沙苑子中沙苑子苷A制備方法優化研究

王 敏，肖順麗，曹青云，李 琦，關亮俊，張宏桂

（北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102）

·實驗研究·

沙苑子中沙苑子苷A制備方法優化研究

王 敏，肖順麗，曹青云，李 琦，關亮俊，張宏桂

（北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102）

目的 以沙苑子為原料，研究簡單、高效的提取、分離、純化沙苑子苷A的方法。方法 以沙苑子苷A的含量為指標，采用正交試驗法優化醇提工藝，所得浸膏經萃取、聚酰胺、硅膠柱分離，甲醇重結晶純化沙苑子苷A，用波譜法、薄層色譜（TLC）法、高效液相色譜（HPLC）法檢查純度。結果 最佳提取工藝條件為，提取次數為3次，加20倍乙醇，提取時間為90 min，乙醇體積分數為70%；分離純化的沙苑子苷A經波譜法、TLC法檢查與對照品一致，經HPLC法檢測純度超過98.50%。結論 優選出的最佳提取工藝提取率高、穩定性好，可為沙苑子苷A的工業化生產工藝提供指導。分離工藝已達到中藥質量檢測用化學對照品技術要求，所選用的分離、純化方法簡單、安全，可行性強，成本低且效率高。

沙苑子；沙苑子苷A；制備；工藝優化

沙苑子為豆科植物扁莖黃芪 Astragaluscomplanatus R.Br的干燥成熟種子[1]，分布于東北、華北及西北地區[2]。本品始載于《神農本草經》，味甘性溫，歸肝、腎經，有溫補肝腎、固經、縮尿、明目等功效，用于腎虛腰痛、遺精早泄、白濁帶下、小便余瀝、眩暈目昏等病癥[1]。沙苑子主要含黃酮類、三萜類、有機酸類、氨基酸等成分，其中黃酮類是沙苑子的主要有效成分，具有許多藥理活性，而沙苑子苷A是沙苑子中主要的生物活性成分之一，具有保護肝細胞、抑制肝纖維化形成的作用[3－8]。沙苑子苷A是2015年版《中國藥典（一部）》中規定的沙苑子藥材質量檢測的對照品[1]。為研究出更簡單、高效的沙苑子苷A的制備方法，本試驗中用聚酰胺、硅膠柱層析分離，甲醇重結晶的方法，快速、高效制得高純度的沙苑子苷A?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 1525型高效液相色譜儀[包括Waters 2489型紫外可見檢測器，SunfireTMC18色譜柱（150 mm× 4.6mm，5μm），美國Waters公司]；BS223S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；薄層色譜及柱色譜用聚酰胺（浙江臺州化工廠）；薄層色譜及柱色譜用硅膠（青島海洋化工廠）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；沙苑子苷A對照品（批號111803－201403）購自中國食品藥品檢定研究院，質量分數大于98.5%；沙苑子藥材購自河北安國藥材市場，經北京中醫藥大學張貴君教授鑒定為Astragalus complanatusR.Br的干燥近成熟種子。

2 方法與結果

2.1 沙苑子苷A含量測定

2.1.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：SunfireTMC18柱（150mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈－0.25%磷酸水溶液（24∶76）；檢測波長：266 nm；流速：1.0m L／min；柱溫：35℃；進樣量：10μL。理論板數按沙苑子苷A峰計應不低于4 000。取對照品溶液、供試品溶液各10μL，按擬訂色譜條件分別進樣測定，其色譜圖見圖1?？梢?，對照品溶液、供試品溶液中沙苑子苷A峰的保留時間一致。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

對照品溶液：稱取沙苑子苷A對照品5mg，精密稱定，加60%乙醇溶解并定容至50mL容量瓶中，搖勻，制成質量濃度為0.1 g／L的對照品溶液[9－13]。

供試品溶液：取沙苑子藥材30 g，置圓底燒瓶中用60%乙醇回流提取，將濾液置已恒重過的蒸發皿中，回收乙醇后轉移至真空干燥箱中至恒重，得到干浸膏，研細，稱取0.05 g，精密稱定，加10m L 60%乙醇溶解，稱定質量，超聲30min，冷卻至室溫后稱定質量，60%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密吸取沙苑子苷A對照品溶液0.4，0.8，1.6，3.2，6.4mL，置10mL容量瓶中，加60%乙醇定容，搖勻，經0.45μm微孔濾膜過濾，分別吸取10μL注入液相色譜儀，在266 nm波長下檢測，記錄沙苑子苷A的峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標、對照品質量濃度（X，g／L）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝3.5×107X＋8 991.9，r＝0.999 2（n＝5）。結果表明，沙苑子苷A質量濃度在0.004～0.064 g／L范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密量取質量濃度為0.016 g／L的對照品溶液10μL，按擬訂色譜條件重復進樣6次，測定峰面積。結果的 RSD為1.23%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：精密稱取相同質量的浸膏6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果沙苑子苷A的平均含量為0.063 6%，RSD為1.52%（n＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液10μL，分別于0，2，4，8，12，24 h時注入高效液相色譜儀，測定峰面積。結果的 RSD為1.78%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的浸膏6份，每份約0.05 g，分別加入沙苑子苷A對照品（0.016 g／L）2 m L，再加60%乙醇，超聲溶解，定容至10 m L容量瓶中，按擬訂色譜條件進樣測定。結果見表1。

2.2 醇提工藝優選

2.2.1 正交試驗設計

按 L9（34）正交表設計沙苑子苷 A的醇提工藝路線，以沙苑子苷A的含量為醇提評價指標，以提取次數（因素A）、乙醇量倍數（因素B）、提取時間（因素C）、乙醇體積分數（因素D）為影響因素進行優化，其因素水平見表2。

2.2.2 正交試驗及結果

精密稱取9份沙苑子粗粉，每份30 g，浸泡0.5 h，按 L9（34）正交表的條件回流提取，提取完畢后，過濾，將濃縮液轉移至已恒重過的蒸發皿中，置真空干燥箱中干燥至恒重，得總浸膏。精密量取0.05 g干浸膏，用60%乙醇定容至10mL容量瓶中，搖勻，備用。結果見表3和表4?？梢姡陨吃纷榆誂含量為指標，因素A各水平間有顯著性差異（P＜0.05），故選擇均值最大的水平，因素B，C，D無顯著性差異。

表1 沙苑子苷A加樣回收試驗結果(n＝6)

表2 醇提工藝優選因素水平表

表3 沙苑子醇提正交試驗及結果(n＝9)

表4 正交試驗方差分析結果

2.2.3 最佳醇提工藝確定

根據大規模實際生產的要求，本著節約的原則，確定沙苑子苷A的最佳提取工藝為A3B3C2D2，即提取次數為3次，加20倍乙醇，提取時間為90min，乙醇體積分數為70%。

2.2.4 驗證試驗

按以上結果分析的最佳醇提工藝，分別各取3批樣品進行試驗，比較和驗證最佳提取工藝的可靠性，結果見表5?？梢姡罴压に嚄l件下所得結果與正交試驗結果相當，表明本提取工藝研究所得結果可靠。

表5 驗證試驗結果

2.3 分離純化

取沙苑子藥材1 kg，按A3B3C2D2工藝條件提取，即用20倍量70%乙醇提取3次，每次90 min，提取液過濾，合并，將濾液回收至無醇味。乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮，置通風櫥揮干。加少量水溶解，濕法上樣于聚酰胺柱，依次用水及10%和15%甲醇洗脫，收集15%甲醇洗脫部位，回收溶劑，干燥，100～200目硅膠拌樣，細粉過 80目篩干法上樣，用乙酸乙酯 －甲醇－水（V∶V∶V，8∶1∶0.6）洗脫，流分至1個柱體積后點聚酰胺薄層板發現開始有沙苑子苷A析出，為沙苑子苷A粗品。收集流分，收集液減壓回收溶劑后，點聚酰胺板合并有相同目標物的流分。將粗品用甲醇溶解成過飽和狀態，放入冰箱，低溫重結晶，重復3次，干燥后即得淡黃色沙苑子苷A純品。

2.4 結構鑒定

沙苑子苷A純品為淡黃色粉末，鹽酸－鎂粉反應呈櫻紅色；酸水解后溶液遇斐林試劑呈陽性反應，三氯化鋁反應呈黃色；二氯氧鋯－枸櫞酸反應鮮黃色消退。1H－NMR（DMSO－d6）：δ8.15（2H，d，J＝8.9 Hz，H－2′，6′），7.15（2H，d，J＝8.9 Hz，H－3′，5′），6.77（1H，d，J＝2.2 Hz，H－8），6.39（1H，d，J＝2.2 Hz，H－6）；5.48（1H，d，J＝7.5 Hz，H－1″），5.02（1H，d，J＝5.1 Hz，H－1″）。根據以上數據分析，與文獻[13]報道一致，故確定為沙苑子苷A。

2.5 純度測定

2.5.1 薄層色譜（TLC）檢測

分別以甲醇－水（2∶3）、丙酮－水（1∶2）為展開劑，在聚酰胺薄膜上進行展開。另于硅膠G板上，以乙酸乙酯－甲醇－水（6∶1∶0.6）進行展開，以1%AlCl3乙醇溶液為顯色劑，在紫外燈365 nm波長下觀察。結果樣品與對照品 Rf值相同，均無雜質斑點。

2.5.2 高效液相色譜（HPLC）檢測

色譜條件同2.1.1項，檢測波長分別為220，254，266，365 nm，樣品用色譜甲醇溶解。取沙苑子苷A對照品與樣品10μL進樣，相應樣品與對照品出峰時間一致，按面積歸一化法計算，沙苑子苷A的純度均達到98.50%，說明樣品純度符合化學對照品的質量要求。

3 討論

現有文獻關于沙苑子苷A提取分離純化的報道較少，且專利多采用反相硅膠、凝膠等，生產成本較高，純化過程使用的氯仿，毒性較大。另有文獻報道采用超聲提取[14－15]的工藝，但提取成本較高，實用性有待進一步探討。

本試驗中的制備工藝包括優化提取、萃取、聚酰胺、硅膠柱分離、甲醇重結晶4個步驟，可簡單、快速地從沙苑子中分離出符合2015年版《中國藥典（一部）》標準的沙苑子苷A對照品，為沙苑子苷A的相關研究和實際生產提供依據。

此外，本試驗中采用價格便宜的聚酰胺和硅膠柱分離，節省了生產成本；僅用乙酸乙酯萃取，在保證萃取完全的條件下，減少了萃取次數及試劑的使用；所用重結晶的試劑為甲醇，其毒性低，對環境污染性小，可回收利用，可用于工業生產。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：183－184.

[2]吳 曉，劉銀芳，劉春宇.沙苑子化學成分研究[J].安徽中醫藥大學學報，2014，33（3）：91－94.

[3]劉 寧，王 軻，馬蘭軍，等.沙苑子總黃酮對運動訓練大鼠血液中某些生化指標影響的實驗研究[J].青海醫學院學報，2006，27（2）：81－85.

[4]劉春宇，顧振綸，張克平，等.沙苑子黃酮抗CCl4大鼠肝纖維化作用及對IFN－γ，TGF－β1的影響[J].中國藥學雜志，2004，39（12）：910－912.

[5]劉春宇，顧振綸，杜崇民，等.沙苑子黃酮對H22荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用及對免疫功能的影響[J].中成藥，2007，29（11）：1690－1692.

[6]劉春宇，顧振綸，杜崇民，等.沙苑子黃酮抗裸鼠人肝癌移植瘤的實驗研究[J].中國藥理學通報，2007，23（6）：781－784.

[7]劉春宇，顧振綸，周文軒，等.沙苑子保肝抗肝纖維化作用及機制研究[J].中國藥理通訊，2003，20（1）：38－39.

[8]劉春宇，顧振綸，韓 蓉，等.沙苑子黃酮對CCl4及 D－氨基半乳糖致急性肝損傷的保護作用[J].中草藥，2005，36（12）：1838－1841.

[9]劉春宇，胡延維，林淼焱，等.沙苑子總黃酮的含量測定[J].蘇州大學學報：醫學版，2002，22（6）：686－687.

[10]張建軍，閆興麗，張玉杰，等.HPLC測定沙苑子中沙苑子苷A的含量[J].中國中藥雜志，2005，30（8）：600－602.

[11]賀 成，唐曉晶，陳玉武，等.高效液相色譜法測定沙苑子及其炮制品中沙苑子苷的含量[J].中國中醫藥信息雜志，2010，17（3）：49－51.

[12]牟 英，彭少平，顧振綸.固相萃取－高效液相色譜法測定沙苑子苷含量[J].中國野生植物資源，2009，28（3）：62－64.

[13]吳文倩，劉銀芳，張 娟，等.沙苑子中沙苑子苷A對照品的制備及鑒定[J].時珍國醫國藥，2010，21（6）：1462－1464.

[14]張清安，范學輝，張志琪.響應面法優化沙苑子中黃酮類化合物超聲輔助提取工藝[J].食品工業科技，2012，33（19）：275－278.

[15]于 猛，竺 梅，王英鋒，等.沙苑子中沙苑子苷A超聲波提取工藝及含量測定[J].首都師范大學學報：自然科學版，2011，32（2）：41－44.

Preparation M ethod of Com p lanatuside A from Astragalus Complanatus

Wang Min，Xiao Shunli，Cao Qingyun，Li Qi，Guan Liangjun，Zhang Honggui
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，China 100102）

Ob jective To study a simple and efficient method of extracting，separating and purifying of Complanatoside A from Astragalus Complanatus.M ethods The extraction process was optimized by orthogonal test.The extract was separated by extraction，polyamide and silica gel column，and Complanatoside A was purified by methanol recrystallization.The purity was checked by spectral，TLC，HPLC methods.Resu lts The optimum extraction conditions were as follows：the extraction time was 3 times，the ratio of liquid to material was 1∶20，the extraction time was 90 min，and the ethanol concentration was 70%.The separation and purification of Complanatoside A accorded with the reference was tested by spectral TLC method.The purity was more than 98.50% tested by HPLC method.Conclusion The best extraction process has the advantages of high extraction rate and good stability，which can provide guidance for the industrial production process of Complanatoside A.The separation process has reached the technical requirements of chemical reference materials for traditional Chinese medicine quality detection.The separation and purification method is simple，safe，feasible，low cost and high efficiency.

Astragalus Complanatus；Complanatuside A；preparation；process optimization

TQ 460.6；R284.2

A

1006－4931(2017)08－0001－04

2017－01－06；

2017－02－23)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.08.001

國家自然科學基金資助項目[3 1 0 7 0 3 2 8]。

王敏（1991－），女，碩士研究生，研究方向為中藥藥效物質基礎，（電子信箱）wangminm18＠163.com。

張宏桂（1 9 5 5－），男，教授，研究方向為中藥藥效物質應用及體內代謝，（電話）0 1 0－8 4 7 3 8 6 4 2（電子信箱）b z y 7 1 4＠163.com。