防治藥用植物土傳病害的芽胞桿菌制劑開發的制約因素分析

高 芬, 郝 銳, 秦雪梅, 雷振宏

(1. 山西大學應用化學研究所, 太原 030006; 2. 山西大學生物技術研究所, 太原 030006; 3. 山西大學中醫藥現代研究中心, 太原 030006; 4. 山西振東道地藥材開發有限公司, 長治 047100)

防治藥用植物土傳病害的芽胞桿菌制劑開發的制約因素分析

高 芬1*, 郝 銳2, 秦雪梅3, 雷振宏4

(1. 山西大學應用化學研究所, 太原 030006; 2. 山西大學生物技術研究所, 太原 030006; 3. 山西大學中醫藥現代研究中心, 太原 030006; 4. 山西振東道地藥材開發有限公司, 長治 047100)

芽胞桿菌是土傳病害生防制劑開發中最具應用潛力的微生物之一,但目前針對藥用植物土傳病害,市場上可供選擇和使用的,以其為生防因子的產品和數量較少,遠遠不能滿足生產實際需要。本文從菌株的篩選獲得、定殖與生態適應性、安全性評價等方面概述了影響其開發的制約因素,并提出了相應的建議和展望,以期為促進芽胞桿菌制劑在防控藥用植物土傳病害中的應用提供參考。

芽胞桿菌; 制劑開發; 藥用植物土傳病害; 制約因素

藥用植物的藥用部位70%為根和根莖[1],而土傳病害的嚴重發生直接降低了藥材產量和品質,給藥材生產造成了重大損失[2]。藥用植物土傳病害種類繁多,發生最普遍的有根腐病、黑腐病、銹腐病等真菌引起的病害[3]。目前該類病害的防治主要依賴于化學農藥,但化學農藥存在毒性高、殘留大、污染重、且病原菌易產生耐藥性甚至抗藥性等缺陷。土傳病害發生環境相對穩定，相對適合微生物的定殖和存活，適宜開展生物防治[4]。利用植株上附生的或根際土壤中的拮抗細菌或其代謝產物調控根圍有害微生物的平衡以達到控病保產的目的是土傳病害防治的重要途徑。

芽胞桿菌是土壤和植物微生態區系的優勢生物種群,具有很強的環境適應性和友好性,能通過分泌抗生物質，調節微生物區系，促進植物生長以及競爭作用等方式發揮多種有益作用[5],在土傳病害的防治中顯示出了巨大潛力,國內外已有不少制劑產品報道,且新的拮抗芽胞桿菌也不斷被篩選出來,針對藥用植物土傳病害,科研工作者也開展了相關工作(表1),但與針對大田作物病害進行的菌株篩選和產品研發相比,其產品數量仍較少,且缺乏作用機制方面的研究。同時,由于次生代謝產物含量較高的藥用植物會引起根際土壤理化性質的改變,導致根際微生物及根際土壤酶活性也發生變化[6],從而使得藥用植物根際的生理生態狀況與農作物有一定差異。目前在這方面的研究還未見相關報道。

表1 土傳病害拮抗芽胞桿菌的篩選及其制劑

從2012年的調查來看,我國登記的農藥有效成分總數600多個,生物源農藥登記品種112個,而微生物農藥僅30個[15],且近一半的生物源農藥品種雖然處于登記狀態,但并未生產。2014年對全國主要生物農藥企業的問卷調查也發現,在已登記的生物農藥產品中,約20%處于未生產狀態,34%為生物農藥與化學農藥的混配制劑[16]。目前,自1982年我國實行農藥登記制度以來,獲得登記的130多種生物農藥[17]中,僅有1種芽胞桿菌制劑(登記證號:LS2001821),登記用于三七根腐病的防治。由此看出,針對藥用植物土傳病害開發的微生物農藥,特別是以芽胞桿菌為目標因子開發的、在市場上可供選擇和使用的生物農藥產品和數量很少,遠遠不能滿足生產實際需要。

生物源農藥的發展與國家政策、研發水平、農業生產方式、市場需求等密切相關,其自身特性、登記管理政策以及用藥成本等因素是制約生物源農藥產業發展的主要因素[16]。芽胞桿菌制劑作為生物源農藥的重要組成部分,阻礙其發展的制約因素有與其他生物源農藥共性的地方,也有因其自身特性導致的差異。本文從拮抗菌篩選獲得、定殖與生態適應性和安全性等3個方面展開論述,以期為避免盲目篩選所導致的后續問題,促進藥用植物土傳病害芽胞桿菌制劑的開發提供參考。

1 拮抗芽胞桿菌的篩選獲得

1.1 菌株來源

對于獲得具有生防潛力的拮抗芽胞桿菌而言,其來源是首要考慮的因素。分離位點優先選擇高病害壓力下植物不發病或少發病的區域。抑病型土壤為選擇天然存在的土傳病害生防制劑提供了一個邏輯位點[18],如Mendes等發現種植于抑病型土壤的甜菜其根際優勢群落普遍為與拮抗病原菌相關的微生物,如放線菌門、β變形菌門、γ變形菌門等[19]。其次,藥用植物根際微生物中細菌具有較高的類群多樣性,其中芽胞桿菌屬Bacillus、假單胞菌屬Pseudomonas細菌最常見[6],也是獲得拮抗菌的良好來源,且因其“土著”性而更容易適應當地生態環境。另外,植物內生菌是防治植物病害的重要微生物資源[20],芽胞桿菌是其中的常見類群。如李勇等[21]從人參根部分離出了具有理想抑菌活性的枯草芽胞桿菌B.subtilisge25。

1.2 分離方法

土壤中芽胞桿菌的分離主要采用先加熱殺死非芽胞細菌,再進行分離的方法[22],但這種方式是針對土壤中能夠培養的微生物進行的。目前發現土壤中超過99%的微生物不能被傳統的技術所分離培養[23],這大大阻礙了拮抗菌的獲得。分子技術克服了傳統培養方法的弊端[24],如宏基因組學技術是完全不依賴于人工分離培養直接獲得環境中理論上所有微生物基因組信息的一種有效手段[25],但單憑分子生物學方法也存在不能得到純培養物的缺陷[24]。純培養物的獲得不僅能夠提供生理學、遺傳學、病理學等研究的對象,也可獲得能夠應用于工業生產的新菌株[26],所以將傳統方法與分子方法相結合,二者互為補充,用分子技術指導分離培養的方向,是我們當前應著重考慮使用的。例如:近年來興起的基于PCR 技術的分子生物學研究方法RAPD、AFLP、RFLP、SSCP、DGGE 等,能分析或鑒定出大部分土壤微生物,且精度高[24]。據此,我們可以根據分離需求,先選擇適宜的分子技術對土壤或植物等分離源進行分析,確定其所含微生物種的豐富度和優勢種群,進而選擇特定的適合待分離菌生長的培養基進行分離,以提高目標微生物的分離率,更迅速地得到所需的菌種。為了克服純培養物獲得過程中環境因素的影響,還可通過培養基的重新設計和優化,準確模擬微生物棲息地的化學條件;也可通過選擇透性濾膜直接進行天然環境原位培養,減少非生物因素對土壤微生物生長的影響[26]。如龔國淑等[22]先將土壤懸液熱處理后,再采用麥芽汁牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基分離土壤中的芽胞桿菌,程序簡單,鑒定的類群也多。

1.3 篩選策略和方法

篩選高效穩定的拮抗菌株是生防菌劑成功研發并保證生物防治獲得成功的先決條件[5]。篩選策略和方法直接決定了獲得菌株的類型。以預防為目的,遵循基本生態學方法的篩選策略主要是基于誘導或提高抑病型土壤的活性,達到對植物較為長期的保護作用;而治療性的策略則將微生物作為生物農藥,以期在有限的時間內控制病害,這在某些方面和化學農藥類似[18]。但這兩種策略在實際的篩選過程中由于拮抗菌株多樣化的作用機制,并不能完全割裂開來。

篩選方法中以平板法篩選產生各種酶類(如溶菌酶、幾丁質酶、葡聚糖酶等)和抗生素、抗菌肽等物質的拮抗芽胞桿菌主要傾向于治療性的策略。以簡便的平板法進行產酶拮抗微生物的篩選可以先于拮抗菌與病原菌和/或植物的互作進行,但作為拮抗菌攻擊的靶標,真菌細胞壁的復雜性要求拮抗菌能迅速產生多種的胞外酶來消解細胞壁組分達到生防效果[18],這就使以單一的酶作為指標篩選獲得的菌株生防效果不能盡如人意。而以芽胞桿菌產生抗生素、抗菌肽等拮抗物質為出發點,通過活體外平板上“抑菌圈”的產生進行篩選已成為評價拮抗菌—靶標菌互作的經典方法。也有研究表明:活體外抗生素的產生和活體內是不相關的[27]。盡管平板法篩選忽略了菌株對植物的誘導抗性,但從獲得能產生高性能抗菌物質菌株的角度來說,依然最為簡單有效。

土傳病害拮抗菌的篩選,除了考慮對病原菌的直接作用外,還將對土壤的調控作用、營養競爭、促生長和誘導抗性作為指標,這類篩選在考慮對病原菌抑制作用的同時,更多地遵循了基本的生態學策略,利于獲得更為高效的菌株。如利用特殊培養基篩選產嗜鐵素的細菌,可獲得對尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum,稻瘟病菌Pyriculariaoryzae和小菌核屬菌Sclerotiumsp. 等土傳病害病原菌具有拮抗作用的假單胞菌屬Pseudomonas,芽胞桿菌屬Bacillus等屬細菌[28]。

傳統平板對峙篩選主要測試供試微生物產生抗生物質的能力,難以明確或預測所選菌株的根際定殖能力[29],也排除了寄主與病原菌敵對關系之間的關聯因子,常使篩選出的菌株性能較差[18]。可見,拮抗菌的有效性不能僅以室內抑菌率來判斷,必須經過大田驗證。然而,活體內試驗獲得的拮抗菌株也有局限性。某些菌株的生化途徑是誘導性的,有的功能在某一環境下可以表達,但改變條件后不再表達;而另一些具有抗菌能力的細菌在傳代過程中所產生的特異性轉化酶容易使其發生“相位變異”,導致在試驗條件下有效的拮抗菌株,在根際條件下卻喪失了作用[30]。

另外,由于藥用植物土傳病害一般由多種病原菌混合侵染引起[2],致病機理多樣,且不同生長期和生長地優勢病原菌差異明顯,而針對單一靶標篩選的拮抗菌不一定對其他病菌有良好的抑制效果,因此篩選方法的選擇應基于菌株呈現復雜性的水平而定,避免因靶標單一造成效果降低。

2 拮抗芽胞桿菌的定殖與生態適應性

2.1 拮抗菌的定殖

拮抗菌穩定的定殖能力是其發揮生防、促生作用的關鍵因素[31],其在土壤及藥用植物根部的生長狀況、定殖時間的長短及定殖數量的變化直觀地反映了菌株定殖能力強弱[32]。以根部入藥的藥用植物多具多年生特性,使得拮抗菌必須在土壤中具有增殖存活更長時間的能力才能產生好的生防效果。首先,由于藥用植物根際微生物有著豐富的類群多樣性和數量多樣性[6],因而作為外來生物的拮抗芽胞桿菌,對土著微生物菌群需具有更強的競爭力,才能在根際競爭中占得有利位置;其次,藥用植物產生的次生代謝產物中的一些小分子物質在栽培生長過程中很容易釋放到環境中,從而改變根際土壤理化性質,進而影響土壤環境的微生物群落結構[33-34],這就要求拮抗芽胞桿菌必須對因根際分泌物積累引起的微生物群落變化有更好的適應性。第三,藥用植物根際分泌物隨著時間的變化對已經引入的生防菌株數量和群落結構也可能產生影響。

另外,有些拮抗菌可以通過產生次生代謝產物來增強其在寄主植物根圍的競爭力,從而在定殖過程中占據優勢[35],如:嗜鐵素、抗生素、水解酶等,所以在拮抗菌的篩選和遺傳改造中,可以將上述能力作為篩選指標和改造靶點,以期獲得定殖力較強的菌株。

芽胞桿菌通常以生物膜的形式定殖于植物根際,表現出較好的定殖能力[36-37]。生物膜不僅可以提高生防菌的生存競爭力,幫助其抵抗抗生素等環境壓力,還能維持其在植物根部的定殖數量,從而提高細菌分泌的胞外酶和抗生素的濃度,保證生防和促生作用的正常發揮[36]。因此,對拮抗芽胞桿菌產生生物膜能力的測定可先于土壤測定來評價其可能的定殖情況。另外,有益的植物內生細菌往往能在植物體內定殖傳導,長期發揮生防作用[38]。

2.2 對環境的適應性

拮抗菌能否適應其被引入的生態環境,充分發揮自身的抑菌機制,與相應病原物有效競爭,決定著生物防治的成敗。拮抗菌在田間環境中的定殖、生長很容易受到紫外光、溫度、化學農藥、水分、pH和營養狀況等因素的影響。對于多年生藥用植物,環境因子可通過對其次生代謝物和根際分泌物的影響改變根際微環境,進而影響拮抗菌的生長環境。如:養分脅迫可導致藥用植物生理代謝的異常變化和根系原生質膜透性的增加,促進分泌物的大量分泌,進而引起植物自毒作用,改變土壤微生物群落結構及土壤pH值,引起土壤物理化學性質的改變[1]。由于大多數實驗室條件下篩選出來的拮抗菌,篩選環境與田間條件有很大區別,因此針對藥用植物土傳病害篩選獲得的目標生防菌,在應用于根際時,除了需要適應自然環境變化所帶來的影響,還要適應由于其生理變化導致的土壤微環境的變化。

此外,芽胞桿菌制劑多為活菌制劑,田間應用時常受到溫度、濕度、土壤、pH值等外界因素的影響,導致防效不穩。要使其在田間施用時可以較長時間地發揮抑菌作用,維護其產生的抗菌物質的穩定性對于確保生防效果非常重要,目前這方面的研究還很欠缺[5]。

3 拮抗芽胞桿菌的安全性分析

3.1 對藥用植物活性成分的影響

藥用植物由于其生產和用途的特殊性,病害防治中使用的農藥必須符合《中藥材生產質量管理規范》(GAP)的要求,既要有效防控病害,又不能影響藥材品質。據報道,芽胞桿菌制劑可直接作用于植物,促進生長,增加產量,提高有效成分的含量[39]。在藥用植物上也有一些相關報道,如:Sharaf-Eldin等[40]發現枯草芽胞桿菌可提高番紅花苦苷、番紅花酸和藏紅花醛的含量;Karthikeyan等[41]報道,芽胞桿菌可以提高長春花抗癌有效成分生物堿的含量。但上述報道只是針對藥用植物中單一或幾種成分進行研究,沒有考慮活性成分的整體變化。近年來,利用以組群指標分析為基礎的植物代謝組學技術來分析植物在非生物或生物脅迫下的應答機制已取得了很大進展[42-44],因此,若將其應用于研究芽胞桿菌對藥用植物活性成分的影響,更利于從整體變化的層面來進行安全性評價。

另外,芽胞桿菌應用后,藥用植物中某一成分含量的顯著升高或降低是否會對其他成分的效果有負面作用,以及芽胞桿菌是否會對藥用植物中的非藥效成分,特別是一些毒性成分產生影響也需引起高度重視。

3.2 對土壤微生物群落及結構的影響

雖然大多數生防菌來自于土壤或植物內生菌,與土壤及植物具有較好的相容性,但將其大量集中釋放到土壤中也可能破壞部分土壤原有微生物的群落結構和功能,并對其構成威脅,從而對整個生態系統產生有害作用[45-46]。其中,最大的潛在影響是引入微生物對土壤小生境中原有微生物的取代,導致土壤生態系統的多樣性和機能下降[47]。生防芽胞桿菌的引入對土壤微生物的類群存在重要影響,例如:連玲麗等[48]報道:枯草芽胞桿菌EN5處理使根際土壤中細菌、真菌和放線菌的數量明顯高于對照土壤,同時,還改善了根際土壤中細菌群體的多樣性;余賢美等[49]報道,施用枯草芽胞桿菌Bs-15 后土壤中細菌的數量變化不明顯,放線菌的數量在第3天和第7天顯著低于對照,第14天以后恢復到對照水平;而真菌種群數量于第7天開始顯著下降。另外,芽胞桿菌對土壤微生物的影響也會因作物的不同而不同,陳雪麗等[50]報道:多黏類芽胞桿菌Paenibacilluspolymyxa和枯草芽胞桿菌B.subtilis對不同時期黃瓜和番茄根際土壤微生物群落結構有不同的影響。向土壤中引入生防菌也可能對群落中原有的非致病真菌產生非目標效應[47],尤其經過基因改良的生防菌,由于它們的某些能力通常被特別加強而更需加以注意。

3.3 對人及有益生物的安全性

相對于化學農藥來說,大多數芽胞桿菌對人畜有益,具有較高的安全性,但進入市場開發的芽胞桿菌必須經過安全測試,對其毒理學、非靶標環境影響、環境繁衍等方面進行綜合評估,才可生產使用。目前我國尚未建立專門的微生物農藥安全性評價技術與相關試驗導則[49],對于微生物農藥的環境安全性評價和藥效評價等均是參照化學農藥的準則,缺乏對其特殊性的考慮,因而盡快建立適合微生物農藥的生態毒理學評價標準、風險評估程序以及藥效試驗準則非常重要[52]。

生防芽胞桿菌除了在土壤中定殖外,還可進入植物體內,特別是來源于植物的內生芽胞桿菌。這些菌進入藥用植物體內后,保留于藥材成品中,在加工及煎煮過程中,定殖的數量和變化尚屬未知。進一步研究這些菌的自身毒性、在植物體內的定殖情況以及在藥材加工過程中的變化,對保障安全用藥至關重要。

4 展望

研究和實踐證明,芽胞桿菌類制劑對土傳病害經濟有效,是僅次于假單胞菌被廣泛研究和商業化的菌種。因此,盡量避免開發過程中的各種制約因素,對于促進芽胞桿菌制劑快速發展,有效防控藥用植物土傳病害非常重要。今后的發展應從以下幾方面加以考慮:

(1) 借鑒醫藥源微生物資源開發的新技術,優選生防微生物發掘的生態環境,擴大篩選范圍和信息獲取量,加強生防微生物新穎性的科學評價,建立新的高效菌株篩選體系,增加新菌株發現的幾率。

(2) 芽胞桿菌在穩定性、與化學農藥的相容性等方面明顯優于非芽胞桿菌和真菌生防菌劑[53],因此將其與化學農藥或植物源殺菌劑復配使用,可使芽胞桿菌形成優勢種群,同時發揮化學藥劑抑菌迅速、防效穩定的優勢,達到優勢互補的目的。

(3) 根據與其他拮抗微生物協同互作,功能互補的原理,將互融的兩種以上的拮抗微生物混用,達到對植物不同空間部位的全面占領,實現多種病害兼防、作用持久的協同控病效果[54]。

(4) 芽胞桿菌可以產生多種重要的酶和抗菌物質,利用生物技術手段生產代謝物產品,也是一條值得探索的途徑。

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(責任編輯：楊明麗)

Factors restricting the development ofBacillusspp. agents againstsoil-borne diseases in medicinal plants

Gao Fen1, Hao Rui2, Qin Xuemei3, Lei Zhenhong4

(1. Institute of Applied Chemistry,Shanxi University, Taiyuan 030006,China; 2. Institute ofBiotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 3. Modern Research Center forTraditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 4. ShanxiZhendong Geo-herbals Development Co., Ltd., Changzhi 047100, China)

Bacillusspp. is one of the microorganisms with great application potential in controlling soil-borne diseases, but the few bio-control agents developed from it on the market cannot meet the growing demands for medicinal plants. This article presented a review on the restricting factors in the development of antagonisticBacillus, including screening, colonization, ecological adaptability and safety evaluation and proposed some measures concerning future research in hope of promoting the development ofBacillusbio-control agents against soil-borne diseases in medicinal plants.

Bacillusspp.; agent development; soil-borne disease in medicinal plant; restricting factor

2016-07-08

2016-09-22

山西省中藥現代化關鍵技術研究振東專項(2014ZD0501-2)

S 436.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.004

* 通信作者 E-mail:gaofen@sxu.edu.cn