鉀肥與生物有機肥配施防治香蕉枯萎病效果初探

秦艷梅, 張志紅, 劉春卯

(1. 河北省微生物研究所, 保定 071051; 2. 江西省科學院生物資源研究所, 南昌 330096)

鉀肥與生物有機肥配施防治香蕉枯萎病效果初探

秦艷梅1, 張志紅2*, 劉春卯1

(1. 河北省微生物研究所, 保定 071051; 2. 江西省科學院生物資源研究所, 南昌 330096)

通過盆栽試驗研究了生物有機肥與氯化鉀和硫酸鉀配施防治香蕉枯萎病的效果。試驗結果表明,兩種肥料配施促進了香蕉苗生長,降低了香蕉枯萎病病情指數,提高了防病效果,生物有機肥與KCl和K2SO4配施防病效果比單施生物有機肥分別高60%和90%。利用T-RFLP分析土壤細菌DNA多樣性,生物有機肥與鉀肥配施提高了細菌三個遺傳多樣性指數,增加了土壤中芽胞桿菌種類。FAME分析也發現生物有機肥以及與鉀肥配施促進革蘭氏陽性細菌和放線菌繁殖,抑制革蘭氏陰性細菌和真菌生長。生物有機肥與鉀肥配施,優勢互補,改善了土壤微生物群落結構,有利于提高防病效果。

生物有機肥; 香蕉枯萎病; 鉀肥; 微生物群落結構

香蕉枯萎病又名香蕉巴拿馬病、黃葉病,是由尖孢鐮刀菌古巴?；虵usariumoxysporumf.sp.cubense引起的香蕉土傳病害,是世界范圍內分布廣、毀滅性最強的植物病害之一[1]。香蕉枯萎病具有很強的傳染性,一旦擴散蔓延則難以控制,發生嚴重時可使整個香蕉園遭到毀滅性打擊。目前還沒有發現有效防治香蕉枯萎病的化學藥劑,而種植抗病品種、與水生作物輪作和施用生防微生物是比較有效的途徑[2]。生防微生物應用較多的有熒光假單孢菌Pseudomonasfluorescens、鏈霉菌Streptomycesviolaceusniger、枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis、哈茨木霉Trichodermaharzianum等[3]。但是單純生防微生物防治香蕉枯萎病速度慢且效果不穩定,可能是這些微生物作為外來物種受土壤條件影響大、不易在土壤中定殖和發揮效果[4]。國內外研究者將生防微生物與有機物質結合使用,期望實現作用持久的防病效果[5-6]。

香蕉是典型的喜鉀作物,在整個生長周期吸鉀量是一般作物的數倍。有學者研究了香蕉對氮、磷和鉀養分需求情況:根系每吸收一份氮,平均吸收磷0.14份,鉀4.14份[7]。鉀不僅是植物生長必需元素,同時與植物的健康關系密切。美國農業部把含鉀較高的化合物硅酸鉀作為生防制劑在有機農業上應用,免除其在食品內/表的限量要求,只要在水解狀態中不超過1%、并按農業規范使用即可[8]。研究者對鉀與植物健康的關系進行了全面的研究和描述,涉及2 400多個試驗,包括400多種病害,鉀肥可提高小麥、油菜、番茄等作物的產量和品質,同時還能明顯控制其病害的發生[9-11]。本研究分析兩種鉀肥配合生物有機肥對香蕉枯萎病的控制效果和對土壤微生態環境的影響,從土壤微生物群落結構變化揭示生物防治香蕉枯萎病的機理,為提高土傳病害控制效果提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試肥料和土壤

生物有機肥:自然風干后的堆肥作為液體菌劑吸附載體(堆肥由雞糞和稻稈厭氧發酵55 d制得),添加本研究所篩選并培養的膠質芽胞桿菌Bacillusmucilaginosus和巨大芽胞桿菌B.megaterium等制成生物有機肥。該生物有機肥中芽胞桿菌含量為0.4×108cfu/g(兩種芽胞桿菌含量分別為0.15×108cfu/g和0.25×108cfu/g)，全氮 21.30 g/kg，全磷15.30 g/kg，全鉀21.40 g/kg，有機質42.3%,含水量26%左右。

鉀肥:氯化鉀和硫酸鉀,均為普通化學試劑。

土壤:采自廣東省廣州市周邊農場蔬菜地,為砂壤土,有機質含量19.00 g/kg，pH 7.25，全N、P、K分別為1.26、0.51和23.88 g/kg。

1.1.2 供試病原菌和香蕉

尖孢鐮刀菌古巴?；虵usariumoxysporumf.sp.cubenserace 4(FocR4)由華南農業大學資源環境學院姜子德教授提供;巴西蕉MusaacuminataAAA Cavendish cv. Brazil營養杯組培苗由廣東省農業科學院果樹研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

試驗采用盆栽方式在溫室內進行。塑料盆大小為高14 cm,直徑18 cm,每盆裝風干土2.5 kg。試驗設置4個處理:①滅菌堆肥(CK),每千克土用量8 g;②生物有機肥(F),每千克土用量8 g;③氯化鉀+生物有機肥(F+KCl);④硫酸鉀+生物有機肥(F+K2SO4)。③與④的鉀肥用量為每千克土施用K2O 0.2 g,生物有機肥用量均為每千克土用量8 g。堆肥滅菌條件:121℃蒸汽滅菌30 min,間隔1 d再滅菌1次。在處理中滅菌堆肥與生物有機肥的干重相同,所有肥料全部作為底肥與土混勻,土壤澆水平衡5 d后移栽香蕉,選擇生長大小一致蕉苗移植。每盆種植2株蕉苗,每個處理12盆,每4盆為一組。香蕉移栽5 d后采用傷根澆灌法接種病原菌,病原菌菌液中孢子濃度為105個/mL,每盆10 mL。香蕉苗栽培60 d后收獲蕉苗,觀察地上部莖、葉黃化和枯萎情況,切開根部記錄褐變程度。香蕉枯萎病分為以下5個標準:0級，植株無枯黃癥狀;1級，植株下部葉片出現輕微的枯黃癥狀,嫩葉完好,少部分根系輕微褐變,莖部出現水漬狀褐變;2級，植株下部葉片出現明顯的枯黃癥狀,但嫩葉完好,根系出現褐變,莖部和假莖部出現水漬狀褐變;3級，整個植株出現枯黃癥狀,根系褐變腐爛,莖部和假莖部褐變連片,少數葉柄出現紅褐;4級，植株出現枯萎死亡癥狀,根系嚴重褐變腐爛[12]。取0～25 cm土壤層中的香蕉根系,不同處理分別取4 株蕉苗,將根系連根帶土采集,混合后放入無菌自封袋帶回實驗室4℃保存,分析微生物多樣性[6]。

1.2.2 利用末端限制性片段長度多樣性(T-RFLP)分析土壤細菌DNA

末端限制性片段長度多樣性(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)操作過程:用美國MO-BIO公司土壤DNA提取試劑盒提取DNA,擴增引物為細菌16S rDNA通用引物,其中正向引物(8～27F):5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,反向引物(1 378～1 401R):5′-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAAC-3′,正向引物5′端用6-羧基二乙酸熒光素(FAM)標記。PCR反應體系為50 μL:正向/反向引物各1 μL,模板DNA 4 μL,dNTPs混合液4 μL,Mg2+溶液4 μL,10×Buffer 5 μL,TaqDNA 聚合酶(TaKaRa公司) 1 μL,用滅菌超純水補足至50 μL。PCR反應條件為:95℃ 3 min;95℃ 1 min,60℃ 30 s, 72℃ 1.5 min,共35個循環;72℃ 10 min。PCR產物用Tiangen公司DNA回收試劑盒純化。純化后的PCR 產物用HhaⅠ (TaKaRa公司) 消化,50 μL反應體系中:HhaⅠ酶2 μL,DNA 43 μL,10×buffer 5 μL,37℃下酶切4 h,然后升溫至65℃將酶滅活[13]。酶切產物由上海基康生物技術有限公司測序分析,把檢測結果上傳至http:∥trflp.limnology.wisc.edu/assignment.jsp進行微生物多樣性分析。根據結果,計算豐富度(richness)、Shannon多樣性(Shannon diversity)和Shannon均勻度(Shannon evenness)。

1.2.3 脂肪酸甲酯法(FAME)分析土壤微生物群落結構

將15 mL 0.2 mol/L KOH-甲醇溶液和相當于烘干重3 g的新鮮土壤加到35 mL離心試管中?；旌暇鶆?在37℃下溫育1 h,加3 mL 1.0 mol/L醋酸于離心管中,混勻。加入10 mL正己烷,使FAME轉到有機相中,480 g離心10 min。將正己烷相轉到干凈試管中,在N2氣流下使溶劑揮發。將FAMEs溶解在0.5 mL 1∶1(V/V)正己烷∶甲基叔丁基醚中,進行GC-MS分析。測試采用日本島津QP-2010GC-MS儀,色譜柱為DB-5(30 m×0.25 mm)石英彈性毛細管柱。采用程序升溫100～260℃,4℃/min。界面溫度為250℃,汽化室溫度250℃,離子源溫度200℃,電子能量70 eV[14]。質譜圖的確認采用NIST62LIB及NIST12LIB譜庫檢索及EPA/NIH質譜標準圖相結合。試驗數據用Excel 2003和SAS V8統計軟件分析。

2 結果與分析

2.1 鉀肥與生物有機肥配施對香蕉植株生長和枯萎病發生的影響

在含有鉀肥和生物有機肥的土壤中培育香蕉苗60 d后測定各處理的單株鮮重,結果表明,施用滅菌堆肥(CK)的香蕉苗單株鮮重顯著低于其他處理;生物有機肥(F)在鉀肥協助下可促進蕉苗的生長(圖1)。硫酸鉀與生物有機肥配施,單株蕉苗鮮重分別比施用滅菌堆肥(CK)和生物有機肥(F)顯著增加40.7%和22.5%,氯化鉀與生物有機肥配施單株蕉苗鮮重分別比CK和F高30.3%和13.5%。單獨或配合鉀肥施用生物有機肥可顯著降低香蕉枯萎病的病情指數,提高預防效果(圖2),硫酸鉀或氯化鉀與生物有機肥配施的防病效果是單獨施用生物有機肥2倍以上。因此,鉀肥不僅可以促進香蕉生長,更可以協助生物有機肥抵抗枯萎病侵害,提高防病效果,并且硫酸鉀效果好于氯化鉀。比較香蕉枯萎病病情指數,CK處理香蕉的病情指數顯著高于其他處理,鉀肥與生物有機肥配施明顯減輕了香蕉發病程度,提高了防病效果(圖2)。

圖1 不同施肥處理對香蕉苗鮮重的影響Fig.1 Effects of different fertilizers on seedling fresh weight

圖2 不同施肥處理對香蕉枯萎病病情指數的影響Fig.2 Effects of different fertilizers on banana wilt disease index

2.2 不同施肥處理對土壤細菌遺傳多樣性的影響

不同施肥處理下土壤細菌的遺傳多樣性指數不同(圖3),施用滅菌堆肥(CK)的土壤豐富度、多樣性和均一度均低于其他施肥處理。土壤細菌遺傳多樣性指數高,代表細菌種類多,因而土壤生態系統的穩定性、和諧性和緩沖能力也較好。采用T-RFLP分析土壤細菌DNA,結果表明,不同施肥處理下芽胞桿菌的種類差異最顯著,施用滅菌堆肥(CK)的土壤僅有3種芽胞桿菌,而單獨或與鉀肥配施生物有機肥后,土壤中芽胞桿菌的種類明顯增加(表1)。土壤中芽胞桿菌種類的增加與生物有機肥中眾多活的芽胞桿菌有關,CK中的堆肥進行了滅菌處理,施入土壤時沒有添加外來細菌,也沒有添加任何可刺激土壤中芽胞桿菌繁殖的物質,CK中芽胞桿菌種類較少,是土壤自身含有;鉀肥與生物有機肥配施后,提高了土壤中芽胞桿菌數量并促進了該屬細菌的繁殖。

圖3 不同施肥處理對土壤細菌遺傳多樣性指數的影響Fig.3 Genetic diversity index of soil bacteria under different fertilizer treatments

處理Treatment可能芽胞桿菌名稱NameofBacillus種類數量/種NumberCKB.arsenicoselenatis,B.sphaericus,B.marismortui3FB.vortex,B.tipchiralis,B.thermoleovorans,B.thermodenitrificans,B.thermoamylovorans,B.sphaericusB.pasteurii,B.arsenicoselenatis,B.caldolyticus,B.caldovelox,B.firmus,B.fusiformis12F+KClB.thermodenitrificans,B.thermoamylovorans,B.subtilisB.sphaericus,B.pumilus,B.pasteurii,B.methanolicus,B.marismortui,B.macroides,B.licheniformis,B.fusiformis,B.firmus,B.fastidiosus,B.benzoevorans,B.caldolyticus,B.caldovelox16F+K2SO4B.caldovelox,B.caldolyticus,B.fastidiosus,B.sphaericus,B.thermodenitrificans,B.thermoamylovorans,B.thermoleovorans,B.subtilis,B.pumilus,B.pasteurii,B.methanolicus,B.macroides,B.licheniformis,B.alcalophilus,B.fusiformis,B.firmus,B.amyloliquefaciens,B.badius,B.benzoevorans19

2.3 不同施肥處理對土壤微生物群落結構的影響

土壤中不同類型的微生物均有其特征脂肪酸,表2列出了幾種類型的微生物特征脂肪酸峰值百分數之和。不同施肥處理對革蘭氏陽性細菌的影響比較明顯,單獨生物有機肥或與鉀肥配施處理革蘭氏陽性細菌(GP)均高于施用滅菌堆肥(CK),這可能與生物有機肥本身含有多種芽胞桿菌有密切關系,該結果在一定程度上也反映了這些細菌的定殖效果,因為芽胞桿菌屬于革蘭氏陽性細菌。革蘭氏陰性細菌(GN)變化規律與GP相反,單獨生物有機肥或與鉀肥配施處理其革蘭氏陰性細菌的脂肪酸甲脂峰值(FAMEs)均低于施用滅菌堆肥(CK)。放線菌FAMEs峰值變化與GP細菌相同,單獨生物有機肥或與鉀肥配施可以提高FAMEs峰值百分比;真菌FAMEs峰值變化趨勢與GN變化規律一致,但是處理之間的差異均沒有達到顯著水平。同時施用生物有機肥和鉀肥,改變了微生物群落結構,特別是提高了GP比例。

表2 不同施肥處理下土壤微生物群落中特征FAMEs峰值百分數1)

1) 同列數據后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。 Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

3 討論

生物有機肥對土傳病害具有一定防治效果,但是防病效果不理想,主要表現為效果較慢,隨著發病時間延長,漸漸失去對病原菌的控制。因此,生物有機肥防治土傳病害常出現“一茬有效,二茬無效;本地有效,外地無效;此作物有效,彼作物無效”的現象。要提高生物有機肥預防病害的效果,還需要同時提高植物本身抵抗病原菌能力,而鉀肥具有這種作用。鉀肥提高植物抗病能力主要有兩個原因:①調控植物代謝過程,通過改變植株體內酶、酚和類黃酮等含量提高植物抗病能力[15-17]。②改變植物形態結構,促進植物組織形成堅韌的角質層、表皮層和厚實的細胞壁,促進木質化和硅質化等抵抗病原菌入侵[18]。也有學者從根際微生物角度研究鉀肥提高植物抗病效果,如小麥施用鉀肥后可有效提高根際紋枯病菌拮抗細菌指數,從而控制紋枯病的發生[9]。劉曉燕等研究認為施用氯化鉀引起玉米根際土壤微生物區系(尤其是真菌數目) 的變化是抑制玉米莖腐病發生的機制之一[19]。本研究中,生物有機肥與鉀肥配施,不僅促進香蕉生長,還明顯提高防治枯萎病的能力。通過T-RFLP和FAME技術分析發現,單獨生物有機肥以及與鉀肥配施,均提高了土壤細菌多樣性和均度,特別是改變了細菌結構組成,芽胞桿菌種類更豐富,革蘭氏陽性細菌增加顯著,這些指標變化與防病效果趨勢相同。因此,可以初步判斷,生物有機肥(含有10種以上具有拮抗作用的芽胞桿菌)進入土壤后建立了穩定的優勢細菌群落,提高了土壤抑制病原菌繁殖效果。在此基礎上施用鉀肥,可通過調節植物根系分泌物含量和種類,進一步加強和優化了土壤細菌群落結構,效果更好。研究中施用硫酸鉀比氯化鉀效果好,可能與硫酸鉀肥料還能提供一定的硫營養有關。土傳病害的防治一方面與土壤微生物數量和多樣性有關,另外還與微生物組成、優勢種關系密切。應用PCR-DGGE研究發現,土壤抑病機理不是改變根際細菌多樣性,而是改變細菌群落組成[20]。FAME可作為革蘭氏陰性細菌(GN)、革蘭氏陽性細菌(GP)、放線菌以及真菌的生物標記物,用各自特征脂肪酸峰面積與總脂肪酸面積的百分比值來表征各微生物類群在土壤微生物群落中的比例[21-22]。Park等研究芽胞桿菌B.subtilis和B.licheniformis防治辣椒疫病時發現,兩種生防細菌改變了土壤微生物群落結構,提高了土壤GP含量,降低了GN,分析結果與本研究一致[23]。Larkin比較了不同類型生物制劑對土壤微生物的影響,認為含GP細菌多的生物制劑,應用到土壤中明顯提高細菌含量,FAME檢測也能發現土壤中GP細菌明顯增多[24]。芽胞桿菌制劑能迅速提高土壤細菌數量,主要與芽胞桿菌抗逆性、抗病性和較強的定殖能力有關。

鉀肥提高生物有機肥防治香蕉枯萎病效果研究,還需要進一步深入分析鉀肥施用量、施用方法以及對病原菌和根際不同種類土著微生物數量的影響。

[1] 魏岳榮,黃秉智,楊護,等. 香蕉鐮刀菌枯萎病研究進展[J]. 果樹學報, 2005, 22 (2): 154-159.

[2] Grosch R, Junge H, Krebs B, et al. Use ofBacillussubtilisas a biocontrol agent Ⅲ. Influence ofBacillussubtilison fungal root diseases and on yield in soilless culture [J].Journal of Plant Diseases & Protection, 1999, 106(6):568-580.

[3] 楊秀娟,杜宜新,甘林,等. 香蕉枯萎病生物防治和抗病育種研究進展[J].中國果樹, 2008(5):42-45.

[4] Getha K,Vikineswary S,Wong W H, et al. Evaluation ofStreptomycesspp. strain g10 for suppression ofFusariumwilt and rhizosphere colonization in pot-grown banana plantlets [J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2005,32:24-32.

[5] Saravanant T, Muthusmy M, Marimuthu T.Development of integrated approach to manage the fusarial wilt of banana[J].Crop Protection, 2003, 22:1117-1123.

[6] 付琳,阮云澤,沈宗專,等. 生物有機肥對連作香蕉根際土壤可培養細菌區系的影響[J].南京農業大學學報, 2012,35(6): 82-88.

[7] 樊小林, 梁有亮, 王孝強, 等. 香蕉營養與施肥[M]. 北京: 中國農業出版社, 2006: 71.

[8] Bekker T F, Kaiser C, van der Merwe R, et al.In-vitroinhibition of mycelial growth of several phytopathogenic fungi by soluble potassium silicate [J]. South African Journal of Plant & Soil, 2006,23(3): 169-172.

[9] 熊桂林,陳懷谷, 李偉, 等. 不同施肥處理對小麥紋枯病發生及根際微生物的影響[J]. 江蘇農業學報, 2008, 24(4): 414-418.

[10]欒非時,郭亞芬,崔喜波.不同施肥對保護地番茄土壤性狀及番茄筋腐病發生的影響[J].東北農業大學學報, 1999, 30(3): 240-244.

[11]李銀水,余常兵,廖星,等. 施肥對油菜菌核病發生的影響[J].中國油料作物學報,2013,35(3): 290-294.

[12]許志剛. 普通植物病理學[M]. 北京: 中國農業出版社, 2002: 236-262.

[13]Lukow T, Dunfield P F, Liesack W. Use of the T-RFLP technique to assess spatial and temporal changes in the bacterial community structure within an agricultural soil planted with transgenic and non-transgenic potato plants [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2000, 32(3): 241-247.

[14]Cavigelli M A, Robertson G P, Klug M J.Fatty acid methyl ester (FAME) profiles as measures of soil microbial community structure [J].Plant and Soil, 1995, 170(1): 99-113.

[15]左麗娟,趙正雄,楊煥文,等.增加施鉀量對紅花大金元烤煙部分生理生化參數及“兩黑病”發生的影響[J].作物學報, 2010, 36(5): 856-862.

[16]李文娟,何萍,金繼運. 氯化鉀對玉米莖腐病抗性反應中酚類物質代謝的影響[J]. 植物營養與肥料學報, 2008, 14(3): 508-514.

[17]劉曉燕,何萍,金繼運.氯化鉀對玉米根系糖和酚酸分泌的影響及其與莖腐病菌生長的關系[J]. 植物營養與肥料學報, 2008, 14(5): 929-934.

[18]劉曉燕,何萍,金繼運.鉀在植物抗病性中的作用及機理的研究進展[J]. 植物營養與肥料學報, 2006,12(3): 445-450.

[19]劉曉燕, 金繼運, 何萍, 等. 氯化鉀抑制玉米莖腐病發生與土壤微生物關系初探[J]. 植物營養與肥料學報, 2007,13(2): 279-285.

[20]Messiha N A S, van Diepeningen A D, Wenneker M, et al. Biological soil disinfestation (BSD), a new control method for potato brown rot, caused byRalstoniasolanacearumrace 3 biovar 2 [J]. European Journal of Plant Pathology, 2007,117(4): 403-415.

[21]Zelles L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review [J]. Biology and Fertility of Soils, 1999, 29(2): 111-129.

[22]蔡燕飛,廖宗文.FAME法分析施肥對番茄青枯病抑制和土壤健康恢復的效果[J].中國農業科學, 2003, 36(8): 922-927.

[23]Park K C, Lim J H, Kim S D, et al. Effects of phytophthora blight-antagonistic microorganismsBacillussubtilisAH18 andBacilluslicheniformisK11 on the soil microbial community [J]. Journal of Applied Biological Chemistry, 2009, 52: 121-125.

[24]Larkin R P.Relative effects of biological amendments and crop rotations on soil microbial communities and soilborne diseases of potato[J]. Soil Biology & Biochemistry, 2008, 40(6): 1341-1351.

(責任編輯：田 喆)

Effects of the combination of bio-fertilizer and potassium fertilizer oncontrol of bananaFusariumwilt

Qin Yanmei1, Zhang Zhihong2, Liu Chunmao1

(1. Hebei Research Institute of Microbiology, Baoding 071051, China; 2. BiologicalResources Institute, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang 330096, China)

The control effects of bananaFusariumwilt (Fusariumoxysporumf.sp.cubense, Foc) by bio-fertilizer (F),and its combination with potassium fertilizers of KCl and K2SO4were studied. The soil microbial community diversity was investigated by FAME and T-RFLP methods under greenhouse conditions.The results showed that bio-fertilizer and the combinations both promoted plant growth, reducedFusariumwilt compared to the sterilized bio-fertilizer (control). The combinations of bio-fertilizer with KCl and K2SO4increased control effect against wilt by 60% and 90% compared to bio-fertilizer treatment alone. The combinations improved soilBacillusspecies and bacterial diversity indexes including richness, Shannon diversity and Shannon evenness. FAME results demonstrated that the combinations promoted Gram-positive bacteria and actinomycetes, inhibited Gram-negative bacteria and fungi compared to control and bio-fertilizer treatment alone. The results suggested that the combinations of bio-fertilizer with potassium fertilizer could effectively control bananaFusariumwilt by enhancing the soil bacterial diversity and improving microbial community structure.

bio-fertilizer; bananaFusariumwilt; potassium fertilizer; microbial community structure

2016-06-26

2016-08-02

國家自然科學基金(41001150)

S 144.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.011

* 通信作者 E-mail:312665645@qq.com