黃葵莖腐病病原菌的分離與鑒定

房云彬, 劉常宏

(南京大學生命科學學院, 南京 210093)

黃葵莖腐病病原菌的分離與鑒定

房云彬, 劉常宏*

(南京大學生命科學學院, 南京 210093)

針對江蘇宜興黃葵主產區發生的黃葵莖腐病,通過分離黃葵植株不同部位(根、莖、葉)以及根際土壤、根圍土壤的微生物,經形態學觀察,結合分子進化分析構建了黃葵不同生態位的微生物物種系統發育樹,對其種類和分布進行了分析。結果表明,細菌優勢類群為芽胞桿菌,而真菌無明顯優勢類群。同時,根據柯赫氏法則測定了分離得到的微生物菌株的致病性,確定了菌株F28可引起黃葵莖腐病,經ITS分子進化分析及形態學觀察,將其鑒定為變紫青霉Penicilliumsanguineum。

黃葵; 莖腐病; 分離; 鑒定; 變紫青霉

黃葵AbelmoschusmanihotL. Medicus為錦葵科Malvaceae秋葵屬Abelmoschus一年生草本植物,又被稱為黃蜀葵花、蜀葵等,分布于我國中南、西南及河北、陜西、山東、浙江、江西、福建等地[1]。黃葵是我國傳統中藥材,其全草入藥具有清熱、涼血、解毒等功效,用黃葵治病療傷在我國歷代醫籍中均有記載,民間應用十分普遍,其藥用歷史悠久,療效明確[2]。

隨著對其有效成分、藥效等研究的深入,黃葵的潛在價值已愈來愈為人們所認識。黃葵集約化種植的發展,使得黃葵病害的防治問題日趨突出。然而,目前關于黃葵的研究多集中于對其種植方式、藥理、活性成分及新藥開發等,而鮮有關于黃葵病害的研究,對嚴重影響黃葵產量的莖腐病的研究尚無報道,其致病菌的分離與鑒定仍是空白。近年來,黃葵莖腐病頻繁暴發,且病害一旦發生即迅速蔓延至整塊栽培地,難以控制,嚴重影響黃葵產業的發展。

本研究采用常規組織分離法,從經表面消毒的莖腐病黃葵植株體內和病田土壤中分離可能的致病微生物,并根據柯赫氏法則,通過致病性試驗確定黃葵莖腐病致病菌株,并采用rDNA ITS分子進化分析和形態學分析方法鑒定該病原菌株,為黃葵莖腐病的防治研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 黃葵莖腐病調查及樣品的采集

黃葵病害調查和樣品采集在江蘇省宜興市太華鎮茂花村進行。分別于2013年7月22日和9月22日,在連作3年的大田中,選取3個區域,每個區域選取1個病株小區、1個健株小區(病情分級為0),每個小區選取3株黃葵,每株黃葵采集部位為根、莖、葉及株下土壤(病株采集部位為發病部位莖、莖葉交界處的葉、莖葉交界處的莖、根及株下土壤,健株采集部位為對應部位)。每個小區面積為1 m2,每個大田區域內小區間的距離為10 m。將采集到的樣品帶回實驗室,對樣品進行編號,詳細描述發病癥狀并統計病情分級情況,病情分級由低到高分為0、1、2、3、4級[3],保存樣本并記錄數據。

1.2 樣品微生物的分離與純化

對采集自18株黃葵的所有植株樣品采用常規組織分離法分離，土壤樣品采用稀釋涂布平板法進行分離。具體如下。

植株樣品微生物的分離純化:每株黃葵按1.1所述選取根、莖、葉3個部位,先用無菌水沖洗,放入75%的乙醇中消毒1 min后,再用無菌水沖洗3次,然后用無菌濾紙吸去多余的水分,剪成0.5 cm×0.5 cm的組織塊,用無菌鑷子將組織塊放在培養基上培養。分離細菌使用LB瓊脂,37℃培養24 h后挑取單菌落轉接至新的培養皿獲得純培養物;分離真菌使用PDA(加入0.5 mg/mL硫酸鏈霉素抑制細菌生長),28℃,黑暗培養5 d后,從長出的菌落邊緣挑取菌絲轉接至新的培養皿,按此方法反復轉接純化,獲得純培養物。

土壤樣品微生物分離和純化:采用稀釋涂布平板法進行細菌和真菌的分離。細菌采用LB平板進行分離,通過畫線獲得單菌落之后,進行液體LB的擴大培養,保種;分離真菌使用PDA(加入0.5 mg/mL硫酸鏈霉素抑制細菌生長),28℃,黑暗培養5 d后,從長出的菌落邊緣挑取菌絲轉接至新的培養皿,按此方法反復轉接純化,獲得純培養物。

真菌單孢株系的制備保存[4]:對分離到的易于產孢的真菌菌株,將其在PDA培養基上(25±1)℃黑暗條件下培養10 d,在無菌操作臺中將菌絲刮下并放入無菌水中用玻璃棒攪拌,用無菌紗布過濾,制備孢子懸浮液,取制備好的孢子懸浮液用血球計數板測濃度,并用濃度梯度稀釋法將孢子濃度稀釋為5×102個/mL,分別取10、20、40 μL涂布于7 cm的培養皿中,(25±1)℃黑暗條件下培養,待剛長出菌落時將其轉接至新的培養皿,得到單孢菌株,于4℃保存菌種備用。

1.3 微生物致病性的測定

細菌:將分離得到的細菌菌株于LB平板37℃培養24 h后,制成3×108cfu/mL菌懸液。用滅菌毛細管在葉片或莖部輕壓組織造成傷口,將菌懸液用滅菌棉簽蘸取,涂布于傷口處,外套塑料袋在28℃恒溫條件下保濕培養。對照組為接種無菌水的葉片和莖,每處理3個重復。48 h后觀察發病情況,描述癥狀并記錄結果。

真菌:選取健康的黃葵植株,采用刺傷接種法。將單孢病原菌菌株活化后,挑少量菌絲轉接到PDA平板上,置于28℃恒溫箱黑暗培養5 d后,沿菌落邊緣用直徑為5 mm的打孔器制菌餅。將健康的黃葵用無菌水沖洗干凈之后,用滅菌毛細管在葉片或莖部輕壓組織造成傷口,將菌餅接在傷口處,外套塑料袋在30℃恒溫條件下保濕培養。對照為接種與菌餅相同大小純PDA培養基的葉片和莖,每處理3個重復。于不同時間持續觀察發病情況,描述癥狀并記錄結果。

選取接種后發病的組織,用前述相同方法再次對病原菌進行分離。獲得再分離菌株后,觀察其與原接種菌株在形態上是否吻合。

1.4 黃葵莖腐病病原菌鑒定

1.4.1 真菌的形態特征觀察

真菌:形態學鑒定以菌株的菌落形態、產孢結構、孢子類型為主要鑒定依據。將菌株接種在PDA平板并在28℃恒溫培養箱黑暗培養5 d。觀察菌落顏色、形態及分生孢子,隨機測量100個分生孢子長寬、縱橫分隔、喙等形態特征的數據,記錄其形態特征,并與文獻描述的特征屬性進行比對。

1.4.2 PCR擴增與分子鑒定

細菌:對分離得到的細菌培養物,挑取單菌落,37℃,150 r/min過夜培養,取3 mL菌液離心棄上清。采用BacteriaGen Kit提取細菌基因組DNA,用細菌16S rDNA通用引物(8f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492r:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR并測序。

真菌:無菌操作刮取平板培養真菌新鮮菌絲100 mg,采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司,Cat:SK8259)]提取真菌基因組DNA,用真菌ITS通用引物(ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′; ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR并測序。

分子鑒定:測序結果分別用http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi網站中的BLAST程序與GenBank中的核酸序列庫進行同源性比較,并從GenBank數據庫中下載相關菌株的16S rDNA 或ITS序列,用軟件MEGA 6.0構建基于16S rDNA 和ITS序列的系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 病害調查和病情描述

黃葵于2013年4月10日播種,7月16日第1次發病,發病率小于10%,調查完畢拔除病株。9月22日第2次調查發病情況,發病區域內,單塊病株區內的植株發病率為100%。發病時天氣濕熱。發病部位一般在新梢上,先從新梢向陽面距地面較近處出現一條暗灰色的似燙傷狀的病斑,長約1.5～5.5 cm,寬0.6～1.2 cm。主要危害莖基部或地下主側根,病部開始為暗褐色,以后繞莖基部擴展一周,使皮層腐爛,地上部葉片變黃、萎蔫,木質部變褐壞死,后期整株枯死,病部表面常有白色菌絲覆蓋。

2.2 黃葵不同部位及病田土壤中微生物的分離

2.2.1 細菌的分離鑒定與分布

采用常規組織分離法及稀釋涂布平板法從感病黃葵葉部、根莖部及其病田土壤中共分離得到13株細菌,16S rDNA分子鑒定和形態學分析結果見表1。其中,所有13株細菌都能從莖部分離得到,11株能從根中分離得到,3株能從葉中分離得到,而6株能從土壤中分離得到(表1)。

表1 細菌鑒定結果及其生態位分布

根據黃葵不同生態位分離細菌的16S rDNA序列同源性,構建細菌的系統發育樹?？蓪⒎蛛x到的13株細菌歸為6個屬:芽胞桿菌屬7株(Bacillussp.),葡萄球菌屬1株(Staphylococcussp.),泛菌屬2株 (Pantoeasp.),節桿菌屬1株 (Arthrobactersp.),庫特氏菌屬1株 (Kurthiasp.);腸桿菌屬1株 (Enterobactersp.),結果表明,細菌在黃葵不同生態位的分類相對比較集中,以芽胞桿菌屬為絕對優勢種群(圖1)。

2.2.2 真菌的分離鑒定與分布

從黃葵植株體內和病田土壤中共分離得到15株真菌,鑒定結果見表2。其中,莖中分離得到15株,根中分離得到10株,而土壤中分離得到9株。

基于ITS序列同源性構建的分離得到真菌菌株的系統發育樹可以看出,真菌比細菌的分支更多更細,相對沒有絕對優勢的種屬,但也主要分為兩支,一支包括F21、F22、F23、F25、F26(97%),這一支主要是藻菌綱的霉菌,另一支則為半知菌類的霉菌和酵母(圖2)。

2.3 莖腐病病原菌的確定

致病性測試結果表明:13株細菌均不能使黃葵感染莖腐病,說明細菌不是黃葵莖腐病的致病菌。而測試真菌中只有編號為F28的分離物能引起典型的莖腐病癥狀(三組重復均發病),且與田間發病癥狀相似,說明F28菌株即為黃葵莖腐病的致病菌。具體表現為:采用刺傷接種法接種健康植株并保濕培養2 d后,觀察到菌塊長出白色菌絲覆蓋住傷口位置,5 d后出現黑褐色病斑,引起的癥狀與自然發病相同,對照組黃葵則未發病(圖3)。而通過剪取接種點上下部莖稈,并按照常規組織分離法分離,獲得分離物的純培養在菌落特征、分生孢子梗、分生孢子形態大小與原始分離物純培養一致,表明F28為黃葵莖腐病病原菌。

表2 真菌鑒定結果及其生態位分布

圖1 細菌菌株16S rDNA序列的最大似然法系統發育樹Fig.1 Maximum likelihood-based phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of the bacterial isolates

圖2 真菌菌株ITS序列的最大似然法系統發育樹Fig.2 Maximum likelihood-based phylogenetic tree based on ITS sequence of the fungal isolates

2.4 菌株F28的形態及分子鑒定

2.4.1 菌株F28的形態特征

在PDA培養基上,F28菌落呈絨狀,表面為黃色,產孢時變為深綠色,背面紅色或紫紅色。在光學顯微鏡下,F28的菌絲、孢子透明,菌絲有橫膈膜;掃描電鏡下,可見分生孢子梗短而光滑,(100～150)μm×(2.5～3.5)μm;分生孢子梗頂端生帚狀的間枝,分枝2次,間枝緊密,5～7個,(10～14)μm×(2.0～2.5)μm;以切離法生成分生孢子,分生孢子呈橢圓形至亞球形,表面極粗糙,大小(3.0～3.5)μm×(2.5～3.0)μm(圖4)。

2.4.2 菌株F28的分子鑒定

菌株F28的ITS片段全長為594 bp。用NCBI的BLAST程序進行同源性比對發現,該菌株的ITS序列與一株Penicilliumsanguineum(JX315663.1)同源性達100%。根據GenBank中相關菌的ITS序列,利用MEGA6軟件構建系統發育樹(圖5)。結合菌株F28的形態特征(帚狀分枝孢子梗及分生孢子,而非Talaromyces屬的子囊孢子)、ITS序列同源性及系統發育樹的分析結果,根據真菌鑒定手冊[5],將該株菌鑒定為變紫青霉Penicilliumsanguineum。

圖3 黃葵莖腐病癥狀Fig.3 Stem rot of Abelmoschus manihot

圖4 菌株F28的形態Fig.4 Morphology of isolate F28

3 討論

通過對感病黃葵及根圍土壤中微生物的分離,共得到13株細菌和15株真菌,采用形態學結合分子進化分析方法對其做了鑒定。在分離到的細菌和真菌當中,有一些是已經報道的植物致病菌,如細菌中的成團泛菌P.agglomerans是玉米細菌莖腐病和稻谷變色的致病菌[6]。真菌中串珠狀赤霉G.moniliformis是導致玉米世界性病害的病原菌,深綠木霉T.aureoviride是某些食用菌的致病菌,葡萄座腔菌B.dothidea能導致樹木潰瘍病,也可引起藍莓枯萎[7]。而鐮刀菌Fusariumsp.可侵染糧食作物、經濟作物、藥用植物及觀賞植物等100余種植物,引起植物的根腐、莖腐、莖基腐、花腐和穗腐等諸多病害[8-10]。此外,占分離到細菌總數60%以上的芽胞桿菌屬Bacillussp.則是一類常見的具有生防作用的細菌,能在植物根際及植物體定殖,促進植物生長,引起植物系統誘導抗性,直接抑制植物病原菌生長等[11]。

圖5 基于菌株F28 ITS序列及相關菌株的最大似然法系統發育樹Fig.5 Maximum likelihood-based phylogenetic tree based on ITS sequence of isolate F28 and related isolates

植物莖腐病病原菌種類較多,一般主要為鐮刀屬Fusariumsp.和腐霉屬Pythiumsp.等。本研究采用柯赫氏法則確定了黃葵莖腐病病原菌為變紫青霉P.sanguineum,而青霉屬引起的植物莖腐病還不多見。此外,植物莖腐病的發病原因復雜[12],可由單一病原菌侵染所致,也可由多種病原菌復合侵染造成植物根系或莖基部腐爛。楊國慧等[13]報道了樹莓莖腐病主要有兩種:一種是真菌Didymellaapplanata引起的刺馬釘狀莖腐病,另一種是真菌Leptosphaeriaconiotltyrium引起的莖腐病,且這兩種病害往往共同發生。然而,關于黃葵莖腐病病原菌分離鑒定的研究還未見報道。本研究結果顯示,變紫青霉是引起黃葵莖腐病的主要致病菌,為黃葵莖腐病的防治研究提供了一定基礎。

此外,胡江春等[14]通過對大豆莖腐病致病因子的研究表明,土壤紫青霉菌分泌的紫青霉菌毒素在大豆整個生育期內均能導致對大豆生長的毒害作用,包括影響種子發芽率和導致大豆共生固氮率下降等。本研究證明,F28菌株會導致黃葵莖腐病的發生,其致病因子及具體發病機制還有待進一步研究。

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(責任編輯：田 喆)

Isolation and identification of the pathogen ofAbelmoschusmanihotstem rot

Fang Yunbin, Liu Changhong

(School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210093, China)

Root rot is an important disease ofAbelmoschusmanihot. By phylogenetic and morphological analysis of the microorganisms isolated from roots, stems, leaves and soil, we investigated the species and distribution of the microorganisms in different parts ofA.manihotplant and rhizosphere soil from the mainA.manihot-producing area in Yixing, Jiangsu Province. Meanwhile, we tested the pathogenicity of all the microorganisms based on Koch’s postulates and determined that strain F28 could cause stem rot ofA.manihot. The strain F28 was identified asPenicilliumsanguineumaccording to its morphology and phylogenetic analysis of ITS.

Abelmoshcusmanihot; stem rot; isolation; pathogen identification;Penicilliumsanguineum

2016-06-08

2016-08-08

國家自然科學基金(31272081,31471810)

S 435.672

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.017

* 通信作者 E-mail：chliu@nju.edu.cn