利用EMA-qPCR建立快速檢測獼猴桃潰瘍病菌活菌的方法

周大祥, 殷幼平, 王中康, 熊 書

(1. 重慶三峽學院生命科學與工程學院, 萬州 404100; 2. 重慶大學生命科學學院, 重慶市基因功能與調控重點實驗室, 重慶 400030; 3. 重慶三峽醫藥高等專科學校基礎醫學部, 萬州 404120)

實驗方法與技術
ExperimentalMethod&Technology

利用EMA-qPCR建立快速檢測獼猴桃潰瘍病菌活菌的方法

周大祥1,2, 殷幼平2, 王中康2, 熊 書3*

(1. 重慶三峽學院生命科學與工程學院, 萬州 404100; 2. 重慶大學生命科學學院, 重慶市基因功能與調控重點實驗室, 重慶 400030; 3. 重慶三峽醫藥高等專科學校基礎醫學部, 萬州 404120)

利用疊氮溴乙錠(ethidium monoazide bromide,EMA)與實時熒光定量PCR技術相結合(EMA-qPCR),建立了一種有效快速檢測獼猴桃潰瘍病菌活菌的方法。以獼猴桃潰瘍病菌ITS序列為檢測靶標,菌體經EMA滲透處理,再進行qPCR特異性擴增。結果顯示,qPCR檢測靈敏度為2 cfu;當EMA的濃度為2.0 μg/mL時,能有效抑制1.0×107cfu/mL經高溫滅活的死菌的擴增,對活菌的擴增沒有影響。當活菌數在1.0×101～1.0×105cfu范圍內,每個qPCR反應體系中活菌數與Ct值呈線性相關(R2=0.988)。不同溫度處理活菌菌懸液后用EMA-qPCR檢測獼猴桃潰瘍病菌的存活情況并與平板計數法進行比較,結果表明待檢樣品可在4℃和20℃短期保存。對疑似帶病獼猴桃材料進行EMA-qPCR檢測,結果表明能減少獼猴桃潰瘍病菌PCR的假陽性結果。本研究建立的EMA-qPCR方法是一種有效檢測獼猴桃潰瘍病菌活菌的方法,能有效避免PCR檢測實際樣品可能造成的假陽性結果。

獼猴桃潰瘍病菌; 疊氮溴乙錠; 實時熒光定量PCR; 活菌檢測

獼猴桃潰瘍病由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種Pseudomonassyringaepv.actinidiae(Psa)引起,是獼猴桃生產中最嚴重的病害之一[1]。目前,獼猴桃潰瘍病菌的檢測主要采用PCR技術,常規的PCR技術不能區分樣品中病原菌的生活狀態,在對活菌DNA進行擴增時,也會擴增自由狀態的DNA或死菌的DNA[2],導致檢測出現假陽性,因此急需建立一種快速有效檢測待檢樣品中獼猴桃潰瘍病菌的方法。

疊氮溴乙錠(ethidium monoazide bromide, EMA)是一種插入型熒光核酸結合染料,其光解后生成的氮賓化合物能夠穿過死菌的細胞膜,與菌體DNA發生不可逆共價結合,因而可抑制死菌中DNA的擴增,但不會抑制細胞膜完整的活菌DNA的擴增[3-5]。EMA-PCR方法僅以活菌DNA分子為檢測靶標,克服了傳統PCR檢測假陽性較高的缺點,使結果更加有效、可靠,已經廣泛應用于各種病原微生物的檢測[6-7]。本研究擬通過EMA-qPCR對獼猴桃潰瘍病菌進行快速檢測,分析EMA對PCR檢測獼猴桃潰瘍病菌死活細菌的影響;同時,初步優化了枝條中獼猴桃潰瘍病菌活菌的EMA-qPCR檢測體系,為獼猴桃潰瘍病的檢驗檢疫提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株:獼猴桃潰瘍病菌Pseudomonassyringaepv.actinidiae菌株C33從重慶黔江染病獼猴桃枝條上分離,由西南大學植物保護學院提供,本實驗室保存。

試劑:疊氮溴乙錠(ethidium monoazide bromide,EMA,Invitrogen)、SYBR?PremixExTaqTMⅡ Mix (TaKaRa)、牛肉膏蛋白胨培養基(BPA)、LB液體培養基。

1.2 方法

1.2.1 獼猴桃潰瘍病菌活菌和死菌的制備

從BPA培養基上挑取獼猴桃潰瘍病菌,接種到20 mL LB液體培養基中,25℃下250 r/min培養過夜,調整菌懸液濃度為1.0×107cfu/mL。取一半活菌懸液100℃水浴加熱10 min,得到死菌懸液。

1.2.2 DNA模板制備

將獼猴桃潰瘍病菌接種至LB液體培養基,25℃下250 r/min培養過夜,A600值在0.4～0.8時,根據《新編分子生物學實驗指南》提供的方法提取DNA[8]。

1.2.3 獼猴桃潰瘍病菌特異性檢測引物以及熒光定量PCR反應條件

獼猴桃潰瘍病菌的ITS序列特異引物[9]PsaF1(5′-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3′)和PsaR2(5′- CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3′)由北京華大基因公司合成。擴增目的片段長度為280 bp。PCR反應體系為25 μL: 12.5 μL SYBR PremixExTaqMix,10 mmol/L PsaF1/PsaR2各0.75 μL,模板DNA 2 μL,加超純水補至25 μL。qPCR反應在CFX96 Real-Time PCR System(Bio-Rad,USA)中進行,PCR反應程序為：94℃預變性2 min；94℃ 15 s,58℃ 30 s,72℃30 s, 30個循環,qPCR擴增完成后隨即分析熔解曲線,擴增特異性驗證。

1.2.4 熒光定量PCR靈敏度檢測

將新鮮培養的獼猴桃潰瘍病菌進行稀釋,取稀釋后的菌液2 μL直接進行熒光定量PCR擴增,同時取對應稀釋菌液1 mL涂布BPA平板,25℃培養48～72 h計數,重復3次。

1.2.5 EMA-qPCR條件優化

于黑暗中分別取1 mL獼猴桃潰瘍病菌的活菌和死菌懸液(1.0×107cfu/mL)避光加入不同濃度的EMA,避光室溫靜置5 min,將離心管置于冰上,打開管蓋,距離650 W鹵鎢燈15 cm,持續曝光10 min[10-11],激活EMA,取2 μL EMA處理的菌液進行熒光定量PCR擴增。

1.2.6 死活菌混合體系中EMA-qPCR的選擇性擴增

將1.0×107cfu/mL的死菌懸液0.5 mL分別與1.0×1010、5×108、1.0×108、5×107、1.0×107、5×106、1.0×106、5×105、1.0×105、5×104、1.0×104cfu/mL的活菌懸液0.5 mL混合均勻,形成不同比例的死、活菌混懸液,取1 mL混合的菌液按1.2.5的方法,用優化濃度的EMA處理菌懸液,取2 μL菌液進行熒光定量PCR擴增。

1.2.7 EMA-qPCR法和平板計數法比較不同溫度處理后獼猴桃潰瘍病菌的存活情況

取1 mL濃度為1.0×107cfu/mL的新鮮獼猴桃潰瘍病菌活菌懸液,10 000 r/min離心5 min,然后加1 mL的超純水中混勻,分別進行-20℃冷凍、4℃冷藏和20℃常溫各處理24 h、48 h和72 h后,按1.2.5的方法,用優化濃度的EMA處理菌懸液,取2 μL菌液進行熒光定量PCR擴增。同時取相應的菌液涂板,25℃培養48～72 h計數。

1.2.8 EMA-qPCR檢測方法的假陽性驗證

按1.2.1制備濃度為107、106、105cfu/mL的獼猴桃潰瘍病菌死菌溶液,比較常規qPCR法、EMA-qPCR法和平板計數法對滅活獼猴桃潰瘍病菌的檢測差異,驗證EMA-qPCR方法檢測是否存在假陽性。

1.2.9 獼猴桃枝干樣品中獼猴桃潰瘍病菌的EMA-qPCR擴增

將四川、重慶等地采集的10份疑似獼猴桃潰瘍病癥狀的枝干洗凈后切成4 mm×4 mm的小塊,無菌水沖洗3次,置于無菌試管中用玻璃棒碾碎,隨后加入800 μL無菌水浸泡2 h,將上層浸泡液分成3部分,一部分進行6 h增殖培養備用；一部分直接加入終濃度為3.0 μg/mL的EMA,按1.2.5的方法進行靜置曝光處理；第三部分浸泡液經熱致死處理后再添加3.0 μg/mL的EMA(對照),并按1.2.5的方法進行靜置曝光處理,提取DNA,按1.2.3的方法進行PCR擴增。

1.2.10 數據分析

采用SPSS 19.0對試驗數據進行t檢驗,P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 熒光定量PCR靈敏度

隨著qPCR反應體系中獼猴桃潰瘍病菌活菌數減少,Ct值逐漸增大,當qPCR反應體系中的活菌數為1 cfu時,熒光定量PCR檢測結果為陰性,因此,熒光定量PCR檢測靈敏度為2 cfu(圖1)。

圖1 熒光定量PCR檢測獼猴桃潰瘍病菌的靈敏度Fig.1 The detection limit of qPCR for Psa

2.2 抑制純培養死菌DNA擴增的最適EMA濃度

對死菌的qPCR檢測結果顯示,添加EMA的各組Ct值與未添加EMA的對照組相比均顯著增加(P<0.05),當EMA終濃度≥2.0 μg/mL時,死菌的PCR擴增被徹底抑制(圖2)。低濃度的EMA(≤10 μg/mL)對活菌PCR擴增抑制不顯著 (P>0.05)。但是,當EMA≥20 μg/mL時,可顯著抑制活菌的PCR擴增(P<0.05)(圖2)。可見,抑制死菌DNA擴增的最低EMA濃度(2.0 μg/mL)遠遠小于影響活菌DNA擴增的最小EMA濃度(20 μg/mL)。因此,我們使用終濃度為2.0 μg/mL的EMA作為純菌培養后續試驗的最佳濃度。

圖2 獼猴桃潰瘍病菌EMA-qPCR檢測體系中EMA濃度優化Fig.2 Optimization of the EMA concentration in EMA-qPCR

2.3 死活菌混合體系中EMA-qPCR選擇性擴增活菌

用5.0×106cfu的死菌與不同數量的活菌混合后加入EMA(終濃度為2.0 mg/L)。結果發現,死菌DNA的擴增被徹底抑制,隨著活菌數目的降低,Ct值逐漸增加,檢測最低限度達到1.0×101cfu (Ct為35.12)(圖3a)。在活菌數為1.0×101～1.0×105cfu范圍內,其cfu數與Ct值呈線性相關,y=-1.915 8x+37.546,相關系數為R2=0.988(圖3b)。此時,通過Ct值可對qPCR中活菌cfu數進行快速定量測定。

2.4 EMA-qPCR檢測不同溫度處理后獼猴桃潰瘍病菌的存活情況

當檢測實際樣品時,可能需要暫時保存待檢樣品,為了明確保存溫度對待檢樣品檢測結果的影響,設計了-20℃、4℃和20℃ 3個常規保存溫度分別保存24、48和72 h,EMA-qPCR檢測獼猴桃潰瘍病菌的存活情況并與平板培養計數法進行比較。結果表明,-20℃冷凍處理時間越長,EMA-qPCR和平板計數結果越低,處理72 h后,EMA-qPCR檢測活菌數為3.7×105cfu,平板計數檢測活菌數為4.1×103cfu,兩種結果顯著差異(P<0.05),顯示獼猴桃潰瘍病菌低溫處理會部分死亡。4℃冷藏和20℃常溫放置24、48和72 h后,兩種方法的活菌測定結果無顯著性差異(P>0.05),且接近對照活菌數,結果表明待檢樣品可在4℃和20℃短期保存(表1)。

圖3 qPCR反應體系中活菌數與Ct值的關系Fig.3 Relationship between the Ct values from EMA-qPCR and the varying number of genomic targets per PCR

處理時間/hTreatmenttime-20℃EMA-qPCR/cfu平板計數/cfu·板-1Platecounting4℃EMA-qPCR/cfu平板計數/cfu·板-1Platecounting20℃EMA-qPCR/cfu平板計數/cfu·板-1Platecounting01.0×107aA1.0×107aA1.0×107aA1.0×107aA1.0×107aA1.0×107aA243.8×106bA6.9×105bB9.9×106aA1.0×107aA9.9×106aA9.9×106aA487.2×105cA6.3×104cB9.9×106aA9.8×106aA1.0×107aA9.8×106aA723.7×105dA4.1×103dB1.0×107aA9.9×106aA9.9×106aA1.0×107aA

1) 同列不同小寫字母表示不同時間處理之間差異顯著(P<0.05);同行不同大寫字母表示相同溫度處理下兩種方法之間差異顯著(P<0.05)。 Different small letters in the same column indicated significant differences between different time treatments (P<0.05); Different capital letters in the same line indicate significant differences between two methods under the same temperature (P<0.05).

2.5 EMA-qPCR檢測方法的假陽性驗證

以常規qPCR法、EMA-qPCR法和平板計數法檢測3個不同濃度的滅活獼猴桃潰瘍病菌,驗證EMA-qPCR 方法對該菌的測定是否會出現假陽性。結果表明,除了常規qPCR法測定到獼猴桃潰瘍病菌外,平板計數法和EMA-qPCR法的測定結果皆為陰性(表2)。表明獼猴桃潰瘍病死菌DNA在短時間內也可作為PCR擴增的模板,常規qPCR法不能有效區分獼猴桃潰瘍病菌死活菌。而EMA-qPCR法僅以活菌DNA為檢測靶標,不會擴增死菌DNA,沒有出現假陽性結果,平板計數法進一步證明了EMA-qPCR法的可靠性。

表2 常規qPCR方法、EMA-qPCR方法和平板計數法測定滅活獼猴桃潰瘍病菌數的比較1)

1) NA: 陰性。 NA: Negative.

2.6 EMA-qPCR檢測疑似獼猴桃潰瘍病枝干樣品

對四川、重慶等地采集的10份疑似獼猴桃潰瘍病枝干樣品(浸泡液未經增殖培養)進行測定,結果發現對照EMA-qPCR測定結果均為陰性,說明獼猴桃枝干樣品中獼猴桃潰瘍病死菌DNA的擴增被完全抑制。來自重慶萬州、四川邛崍和四川崇州的樣品EMA-qPCR檢測結果為陰性,與平板培養結果一致,這3份樣品經過培養后,EMA-qPCR檢測結果還是陰性(數據未列出),而qPCR檢測結果均為陽性,說明這3份樣品中的獼猴桃潰瘍病菌雖然已經死亡，但DNA序列還沒有完全降解。結果表明EMA-qPCR法可以代替平板培養法快速檢驗獼猴桃潰瘍病。

表3 疑似感染獼猴桃潰瘍病的枝干樣品的檢測

3 討論

普通PCR技術可以快速鑒定細菌,但不能將死菌和活菌區分開。由于EMA具有選擇性[12-13],它只能進入細胞壁(膜)不完整的死細胞內,不能進入細胞壁(膜)完整的活細胞。因此,將EMA與qPCR方法相結合,能快速、準確地區分實際樣品中的死菌和活菌,有效降低傳統PCR檢測的假陽性。EMA-qPCR目前已經廣泛應用于食源致病微生物[14-16]和醫學病原微生物[17]的檢測中,但在果樹病原菌的檢測上報道極少[18]。

本研究首先選用純化的獼猴桃潰瘍病菌進行EMA-qPCR方法研究,結果表明,當EMA終濃度≥2.0 μg/mL時,107cfu/mL濃度死菌的DNA擴增可被徹底抑制。死菌和活菌混合試驗表明,檢測最低限度為1.0× 101個活菌,在活菌數為1.0×101～1.0×105cfu內,其cfu與Ct值呈線性相關,此時,以Ct值可對qPCR中活菌cfu進行快速定量測定。

在實際樣品測定時,可能需要暫時保存待檢樣品。我們測試了不同溫度短時間保存獼猴桃潰瘍病菌后其存活情況。結果表明,活菌經過-20℃保存72 h后,EMA-qPCR法檢出的活菌數高于平板計數法,原因可能是低溫短期處理后的死亡菌體仍能保持細胞壁(膜)完整,使EMA染料無法滲透進入[19-20]。4℃和20℃保存72 h,兩種方法的活菌檢測結果一致,且接近對照活菌數,但EMA-qPCR法耗時更短,大大縮短了測定時間。綜合試驗結果表明,獼猴桃潰瘍病待檢樣品可在4℃和20℃短期保存,不會影響測定結果,但不能在-20℃冷凍短期保存。

目前,EMA結合PCR技術檢測實際樣品中的病原菌報道極少[18]。EMA-qPCR檢測疑似獼猴桃潰瘍病枝干樣品時,因為獼猴桃枝干中未經增殖培養的浸泡液細菌總濃度不會超過1.0×107cfu/mL,同時獼猴桃枝干中的非靶標死菌可能會消耗掉一部分EMA,因此我們選擇的EMA濃度為3.0 μg/mL(比純菌條件下稍高)。結果表明,10份對照樣品EMA-qPCR檢測結果都是陰性,說明EMA在獼猴桃枝干樣品檢測中抑制獼猴桃潰瘍病菌死菌DNA被擴增的效果比較理想。其中3份樣品的EMA-qPCR測定結果與qPCR測定結果不同,與平板培養結果相同,表明EMA-qPCR方法比qPCR法更能克服假陽性的出現,準確反映實際樣品的帶菌情況,并且比平板培養法檢測時間更短。

有時,實際樣品中存在的活菌數可能非常少,低于qPCR的最低檢測下限,這樣EMA-qPCR檢測可能會出現假陰性[21]。因此當未經增殖培養的浸泡液檢測結果為陰性時,必須經過增殖培養后再次進行EMA-qPCR檢測,才能確定實際樣品中是否有活菌存在。

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(責任編輯：楊明麗)

Establishment of a method to rapidly detect only viable cells ofPseudomonassyringaepv.actinidiaeby EMA-qPCR

Zhou Daxiang1,2, Yin Youping2, Wang Zhongkang2, Xiong Shu3

(1. College of Life Science & Engineering, Chongqing Three Gorges University, Wanzhou 404100, China; 2. College ofLife Science, Chongqing University, Chongqing Key Lab of Genetic Function and Regulation, Chongqing 400030, China;3. Department of Basic Medicine, Chongqing Three Gorges Medical College, Wanzhou 404120, China)

A method to rapidly detect only viable cells ofPseudomonassyringaepv.actinidiae(Psa) was established by EMA-qPCR. The ITS sequence was used as the target gene for qPCR detection of Psa. Samples were treated with EMA prior to DNA extraction. DNA was then amplified by qPCR to detect only viable Psa cells. The sensitivity of qPCR detection was 2 cfu. 2 μg/mL EMA could completely inhibit the PCR amplification of DNA derived from dead cells with the concentration of 1.0×107cfu/mL, but no inhibition to viable cells. A standard curve was generated relating the number of viable cells to theCtvalues of the EMA-qPCR. A linear range of DNA amplification was observed from 1.0×101-1.0×105cfu genomic targets per PCR. EMA-qPCR method was used to evaluate the survival rate of Psa treated with different temperatures for a short time, and compared with the method of plate counting. The results indicated that samples can be stored for a short time under 4℃ and 20℃. The data of EMA-qPCR detection on kiwifruit field samples indicated that 3 μg/mL EMA could successfully inhibit PCR amplification of DNA from dead bacteria in filed samples. The EMA-qPCR method established in this study can effectively avoid false positive results of Psa detection.

Pseudomonassyringaepv.actinidiae; ethidium monoazide bromide; real-time PCR; detection of viable bacteria

2016-05-21

2016-07-20

重慶市自然科學基金(cstc2016jcyjA2026);重慶市教委科學技術研究項目(KJ1502601);重慶三峽學院校級重點項目

S 436.634.12

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.024

* 通信作者 E-mail: dqzhou79@163.com