北京地區主栽西瓜品種種子攜帶真菌檢測及鑒定

耿麗華, 宋順華, 蘆 鈺, 史 越, 徐秀蘭

(北京市農林科學院蔬菜研究中心, 農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點試驗室,農業部都市農業(北方)重點實驗室, 北京 100097)

調查研究
Investigations

北京地區主栽西瓜品種種子攜帶真菌檢測及鑒定

耿麗華, 宋順華, 蘆 鈺, 史 越, 徐秀蘭*

(北京市農林科學院蔬菜研究中心, 農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點試驗室,農業部都市農業(北方)重點實驗室, 北京 100097)

用離體平皿法對北京西瓜產區主栽的11個西瓜品種進行種子帶菌檢測、分離純化和形態學、ITS序列比對,確定其屬或種地位。結果表明:不同品種所帶真菌種類有差異,種子表面攜帶的優勢菌群主要為曲霉屬Aspergillusspp.、青霉屬Penicilliumspp.、鏈格孢屬Alternariaspp.和鐮刀菌屬Fusariumspp.;種子內部寄藏真菌主要為青霉屬、根霉屬Rhizopusspp.和曲霉屬。種子外部檢出的主要病原菌有鐮刀菌屬的F.verticillioides,F.proliferatum及莖點霉Phomasp.;種子內部檢出的病原菌有F.verticillioides和F.oxysporum。不同品種間種子表面攜帶真菌量與種子內部攜帶真菌率差異顯著,但種子外部帶菌量和內部種仁帶菌率之間無顯著相關性。本研究對開展西瓜種子處理研究有借鑒意義。

西瓜; 種子帶菌; 真菌鑒定

我國是世界上最大的西瓜生產和消費國。西瓜種植面積居世界首位,約占世界總面積的40%。西瓜在我國南北地區種植普遍,有良好的經濟效益[1-2]。由于目前主流的西瓜品種均為雜交種,必須每年購買商業種進行播種,采取有效措施提高商業種的質量是西瓜實際生產中需要解決的重要問題。本試驗通過對北京主要西瓜種植地區的11個西瓜品種種子進行檢測,旨在了解西瓜種子攜帶真菌情況,為后續實際生產過程中進行種子處理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試西瓜品種

供試西瓜品種共11個,分別為‘暑寶6號’、‘天驕二號’、‘超越夢想’、‘綠小帥’、紅小帥’、‘四季小鳳’、‘特大早春紅玉’、‘全美2K’、‘北農福田’、‘京欣一號’、‘北農天驕’。其中‘綠小帥’和‘四季小鳳’產自甘肅,其余均產自新疆。

1.2 種子帶菌檢測

1.2.1 種子外部帶菌檢測

每個品種隨機選取100粒種子,放入滅菌的250 mL三角瓶中,加50 mL無菌水并充分振蕩,吸取全部懸浮液,4 000 r/min離心10 min,倒去上清液,加1 mL無菌水均勻懸浮沉淀,取適量懸浮液用無菌水進行系列梯度稀釋,每個稀釋梯度菌懸液吸取100 μL均勻涂布到直徑9 cm 的PDA平板上(PDA 中加0.06%乳酸抑制細菌),每個濃度3皿,置于20℃恒溫箱中黑暗條件下培養,5 d后觀察記錄平板上的菌落總數,根據稀釋倍數和檢測種子數計算種子外部攜帶的孢子負荷量和檢出真菌的分離比例。每個供試品種重復4次。

孢子負荷量(cfu/粒)=3皿菌落總數/0.3 mL×稀釋倍數/100;

分離比例(%)=(某類真菌菌落個數/菌落總數)×100。

1.2.2 種子內部帶菌檢測

每個供試品種隨機選取40粒種子在1%的次氯酸鈉溶液中浸泡1 min,然后用無菌水沖洗3次, 在培養皿底部鋪兩層滅菌濾紙,將種子倒入其中,用無菌濾紙吸干種子表面的無菌水;然后用無菌解剖刀將種子解剖為種皮和種胚,將種皮和種胚分別均勻擺放在直徑為15 cm的 PDA平板上,每個平皿擺放20塊組織,每個品種種皮和種仁分別擺放兩個平皿;25℃恒溫箱中黑暗條件下培養,7 d后觀察記錄。每個供試品種重復4次。

種子帶菌率(%)=(帶菌種子數/檢測種子總數)×100;

種子帶鐮刀菌率(%)=(帶鐮刀菌種子數/檢測種子總數) × 100;

某菌分離頻率(%)=(帶某類菌種子數/帶菌種子總數)× 100。

1.2.3 蔓枯病菌檢測

每個供試品種隨機選取150粒種子,用0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min消毒,采用濾紙發芽法,25℃暗培養10 d后觀察發芽情況,將疑似病株轉移至另一紙床上于25℃,12 h光照,12 h黑暗條件下,培養4～5 d。在解剖鏡中找到分生孢子器或假囊殼,而后用電子顯微鏡觀察孢子的大小形態等進行形態學鑒定[3]。

1.3 種子帶菌鑒定

將分離到的各種真菌轉移到PDA培養基進行純化、轉管保存、通過鏡檢進行形態學鑒定。同時將純化菌株送至三博遠志公司(北京)進行真菌ITS測序。通過序列比對確定其屬地位。

1.4 數據處理與分析

不同品種的帶菌率差異采用SAS軟件進行分析;種子外部帶菌量和內部帶菌率相關性分析采用Minitab回歸分析。

2 結果與分析

2.1 西瓜種子外部帶菌檢測結果

檢測結果(表1)表明，種子外部帶菌量差異較大,在所檢測的11個品種中,‘超越夢想’外部帶菌量最高,每粒種子的平均孢子負荷量為22 cfu,且與其他品種差異顯著;‘天驕二號’、‘紅小帥’、‘四季小鳳’、‘全美2K’及‘北農福田’種子外部孢子負荷量為0。種子外部攜帶的優勢菌群為鏈格孢屬Alternariaspp.、青霉屬Penicilliumspp.、曲霉屬Aspergillusspp. ;此外,還有鐮刀菌屬Fusariumspp.、木霉屬Trichodermaspp.、毛霉屬Mucorspp.和根霉屬Rhizopusspp.。其中致病菌包括串珠鐮刀菌Fusariumverticillioides、層出鐮刀菌F.proliferatum及莖點霉Phomasp.。

2.2 西瓜種子內部帶菌檢測結果

2.2.1 種皮帶菌率

不同品種種皮帶菌率差異較大(表2),‘超越夢想’種皮帶菌率最高,為10.6%,與除‘特大早春紅玉’和‘京欣一號’外的其他品種差異顯著;‘北農天驕’種皮沒有檢測到真菌。種皮攜帶的優勢菌群為鏈格孢屬Alternariaspp.、青霉屬Penicilliumspp.、曲霉屬Aspergillusspp.;此外還有木霉屬Trichodermaspp.、鐮刀菌屬Fusariumspp.。其中3個品種‘超越夢想’、‘天驕二號’、‘全美2K’檢出鐮刀屬致病菌F.oxysporum及F.verticillioides。品種‘紅小帥’只檢測到了青霉屬真菌,而‘特大早春紅玉’、‘四季小鳳’及‘北農福田’只檢測到了曲霉屬真菌。

表1 西瓜種子外部攜帶真菌檢測結果1)

1) 表中同列數值帶有相同字母的差異性不顯著(P≤0.05);-表示未分離到該類真菌。下同。 Means followed by the same letter within a column are not significantly different atP≤0.05; - indicated the genera were not detected. The same below.

表2 西瓜種子種皮攜帶真菌檢測結果

2.2.2 種仁帶菌率

各品種種仁帶菌率差異較大(表3),‘紅小帥’、‘綠小帥’種仁帶菌率最高,分別為6.9%和6.3%,與除‘暑寶6號’以外的其他品種差異顯著；‘北農天驕’種仁沒有檢測到任何真菌。種仁攜帶的優勢菌群為鐮刀菌屬Fusariumspp.、青霉屬Penicilliumspp.和曲霉屬Aspergillusspp.;此外還有毛霉屬Mucorspp.和木霉屬Trichodermaspp.。其中‘暑寶6號’只檢測到了青霉屬真菌,而‘特大早春紅玉’、‘四季小鳳’只檢測到了曲霉屬真菌。此外,‘天驕二號’、‘超越夢想’、‘紅小帥’和‘全美2K’4個品種的種仁也檢測到鐮刀菌屬致病菌F.oxysporum及F.verticillioides。

表3 西瓜種子種仁攜帶真菌檢測結果1)

2.3 種子攜帶蔓枯病菌檢測結果

所有品種的檢測樣本均未檢測出攜帶蔓枯病菌。

2.4 種子外部帶菌量和內部帶菌率的相關性分析

種子不同部位帶菌量相關性分析結果表明:種子外部帶菌量與種皮帶菌率呈顯著正相關關系(P=0.015<0.05)(圖1);而外部帶菌量與種仁帶菌率并無相關性。種子內部種皮與種仁帶菌率無相關性(表4)。說明種子外部攜帶真菌量可以推測種皮的感染情況,但是不能推測種仁的感染情況。

3 結論與討論

本文對北京地區的11個市售西瓜品種的種子進行攜帶真菌檢測,結果表明不同品種之間攜帶真菌情況差異較大。西瓜種子外部攜帶的優勢菌群隸屬于鏈格孢屬、青霉屬、曲霉屬及根霉屬;種子內部寄藏的真菌主要隸屬于青霉屬、曲霉屬、鐮刀菌屬及鏈格孢屬。種子內部主要的致病菌為鐮刀菌屬F.oxysporum、F.verticillioides；種子外部攜帶的致病菌主要為F.verticillioides,F.proliferatum及莖點霉Phomasp.。

表4 種子不同部位帶菌量相關性分析結果

圖1 種子外部帶菌量與種皮帶菌率的相關性分析Fig.1 Correlation analysis of the amount of spores isolated from seed surface and infection rate of seed hull

在受檢的11個品種中,在3個品種上檢測到了鏈格孢屬真菌。大多數情況下,鏈格孢為附生真菌,但也有鏈格孢屬真菌如A.cucumerina、A.cucurbitae在適宜的環境條件下可以引起西瓜幼苗感病[4-5]。在‘綠小帥’、‘超越夢想’、‘紅小帥’、‘全美2K’上均檢測到了尖孢鐮刀菌F.oxysporum。吳學宏等的試驗表明,用西瓜種傳尖孢鐮刀菌處理西瓜種子后,其發芽勢、發芽率和發芽指數均顯著降低[6]。此外,還分離到了彎孢霉Curvularialunata(‘綠小帥’)、莖點霉Phomasp.(‘特大早春紅玉’、‘綠小帥’)及綠核菌Villosiclavavirens(‘超越夢想’)等植物病原菌。與吳學宏等2003年針對西瓜種子的帶菌檢測結果[7]相比,此次檢驗的種子帶菌率大大降低,也說明了商品種種子健康質量有所提高。

蔓枯病(gummy stem blight)又稱黑腐病,是影響西瓜產量的重要病害之一,同時果實品質也會受到極大影響,蔓枯病是種傳病害,種子攜帶病菌率在5%～30%[8]。試驗表明種子攜帶蔓枯病病菌對西瓜種子發芽率及幼苗的長度、鮮重等指標均有影響[9]。所以在西瓜種子健康檢測中檢驗蔓枯病菌的攜帶情況是很有必要的。在此次試驗中檢測的11個品種中均沒有檢出攜帶蔓枯病菌。

對種子不同部位帶菌量相關性分析可以發現,

種子外部帶菌量與種皮帶菌率相關,而與種仁帶菌率不相關。推測可能是由于制種公司在制種過程中對種子進行了一些處理,消除了種子外部的部分真菌,而目前的種子處理并不能高效地降低種子內部種仁的帶菌量,從而導致種子外部未檢出真菌,而種子內部檢測到一定比例的病菌。因此,種子外部帶菌量的高低并不能用來推斷種子內部帶菌情況。

已有試驗證明適當的藥劑消毒處理可以有效地降低種子真菌攜帶量,并對西瓜苗期的病害有一定的防治效果[10-11]。而在對種子進行適當的藥劑處理后配合催芽可以有效提高出苗率[12]。種子是豐產的基礎,如何有效提高種子的質量,降低商業種攜帶植物病原菌量,提高種子出芽率是我們需要進一步研究的課題。

[1] 中國農業科學院鄭州果樹研究所. 中國西瓜甜瓜[M].北京: 中國農業出版社, 2000.

[2] 程美仁. 西瓜種子帶菌檢驗方法及次氯酸鈉消毒的效果[J]. 北方園藝, 1995(1): 32-33.

[3] ISHI-Cb 2.2-Vegetables Blotter Assay,Didymellabryoniae-Cucurbit, Version 0.4, 2000.[EB/OL].http://www. seedhealth.org/ seed-health-methods.

[4] 賈菊生, 李新輝. 新疆瓜類由鏈格孢霉(Alternaria)侵染所致兩類葉斑病的紀錄及鑒別[J].新疆農業科學, 2002, 39(6): 348-351.

[5] 崔迪, 王繼華, 陳捷, 等. 鏈格孢屬真菌對農作物的危害[J]. 哈爾濱師范大學自然科學學報, 2005(4): 87-91.

[6] 吳學宏,韓魯明,陳倩,等.西瓜種傳鐮刀菌形態和分子鑒定及其對種子發芽的影響[J].植物病理學報,2009,39(2):118-124.

[7] 吳學宏, 劉西莉, 劉鵬飛, 等. 西瓜種子帶菌檢測及殺菌劑消毒處理效果[J]. 農藥學學報, 2003, 5(3): 39-44.

[8] 云曉敏, 孔祥飛, 劉明輝, 等. 西瓜蔓枯病菌對西瓜種子發芽和幼苗生長發育的影響[J]. 種子, 2006, 25(8): 60-61.

[9] 劉書林, 顧興芳, 石延霞, 等. 瓜類蔬菜蔓枯病研究概況[J]. 中國蔬菜, 2013(18): 1-10.

[10]李健強, 沈其益. 殺菌劑處理種子防治作物種苗期病害研究進展[J]. 中國農學通報, 1994, 10(6): 16-19.

[11]張龑, 寇明明, 孫小武. 西瓜播種前種子處理概述[J]. 中國瓜菜, 2007(4): 29-31.

[12]徐秀蘭, 宋順華, 耿麗華, 等. 種子處理對西瓜出苗率和幼苗長勢的影響[J]. 中國瓜菜, 2014(6): 15-17.

(責任編輯：楊明麗)

Detection and identification of seed-born fungi of mainwatermelon varieties in Beijing area

Geng Lihua, Song Shunhua, Lu Yu, Shi Yue, Xu Xiulan

(Vegetable Research Centre, Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Key Laboratory ofBiology and Genetic Improvement of Horticultural Crops (North China), Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Urban Agriculture(North), Ministry of Agriculture, Beijing 100097, China)

Seed-born fungi of 11 main watermelon varieties sold in Beijing were detected by culture test, and further purified and identified by morphology and ITS sequencing. The results indicated that seed-born fungi were different among varieties. The dominant seed-borne fungi on the seed surface wereAspergillusspp.,Penicilliumspp.,Alternariaspp. andFusariumspp.. The genus ofPenicilliumspp.,Rhizopusspp. andAspergillusspp. were the main internal seed-born fungi.Fusariumverticillioides,F.proliferatumandPhomasp. were isolated from external seed, andF.oxysporumandF.verticillioideswere isolated from internal seed. Both the amounts of fungi on seed surface and infection rate of internal seeds were significantly different among varieties. However, there was no correlation between the amount of fungi from seed surface and the infection rate from internal seeds. The result of this study will be helpful for development of seed treatment in watermelon production.

watermelon; seed-borne fungi; fungi identification

2016-06-21

2016-08-29

北京市自然科學基金(6154024);現代農業產業技術體系北京市西甜瓜創新團隊專項;北京市農林科學院新學科培育(KJCX20150202)

S 482.2

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.027

* 通信作者 E-mail:xuxiulan@nercv.org