黃芪熟地生曬參勾兌型保健黃酒研究

謝杜梅，高 霄，張 蕾，周建弟，蔣予箭

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州310018； 2.國家黃酒工程技術研究中心，浙江紹興312000）

黃芪熟地生曬參勾兌型保健黃酒研究

謝杜梅1，高 霄1，張 蕾1，周建弟2，蔣予箭1

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州310018； 2.國家黃酒工程技術研究中心，浙江紹興312000）

以黃芪、熟地、五味子、生曬參、麥冬為原料，確定勾兌型保健酒的最佳提取工藝。采用熱水回流提取工藝，以單因素實驗和正交實驗對保健酒提取工藝因子進行考察，以有效成分總多糖和總皂苷含量作為參考指標。最終確定最佳提取工藝參數為水浴溫度70℃，回流提取時間5 h，乙醇含量10%，料液比1∶25。以最優工藝參數提取的保健酒的總多糖提取率為58.92%，總皂苷的提取率為11.20%。

黃芪； 熟地； 保健黃酒； 多糖； 皂苷； 提取工藝優化

隨著人們消費意識和生活水平的提高，保健酒市場規模越來越大，中國勁酒、椰島鹿龜酒、致中和五加皮等龍頭企業發展迅速。但是市場上的保健黃酒種類不是很多，還有很大的發展前景。因此，擬研究開發一款具有提高人體免疫力功能的黃酒。

現代藥理表明，黃芪中含有的黃芪多糖、皂苷等化合物具有較強的生物活性[1]。艾志瓊等[2]的研究表明，黃芪多糖主要作用于多種免疫活性細胞，促進細胞因子的分泌和正常機體的抗體生成?，F代藥理表明，熟地對造血系統、內分泌、神經系統、心腦血管及免疫系統等均有一定作用[3]。李發盛等[4]的研究表明，熟地多糖具有提高小鼠免疫功能的作用?，F代藥理研究表明，人參含有人參皂甙等營養物質，具有滋補強壯、提高體力和腦力勞動能力，降低疲勞的療效[5]。張劍平等[6]的研究表明，生曬參偏于補益氣陰，增強機體抵抗力，發揮免疫調節作用。多糖屬于天然大分子物質，能夠激活免疫細胞，促進細胞因子分泌，從而調節免疫系統，發揮抗腫瘤、抗氧化等作用[7]。人參皂苷是目前研究的熱點，已有研究表明，人參皂苷在心血管系統、中樞神經系統、免疫調節、抗白血病等方面均有作用[8]。因此本實驗在確定保健黃酒配方原料的基礎上，主要選取了多糖和皂苷作為工藝優化的指標。

本研究主要以熟地、黃芪、麥冬、五味子、生曬參為組方，通過熱水回流工藝提取中藥中的多糖和皂苷等有效成分。先通過水浴溫度、回流時間、乙醇含量和料液比4個單因素實驗，確定各個因素的最佳水平，然后通過正交實驗確定原料中有效成分提取的最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

原料：黃芪、熟地、五味子、生曬參、麥冬，杭州胡慶余堂大藥房。古越龍山陳三釀15%vol紹興黃酒，購于當地超市。

耗材及試劑：無水乙醇，苯酚，濃硫酸，香草醛，甲醇，所用試劑均為分析純；D101大孔吸附樹脂，葡萄糖，人參皂苷。

儀器設備：恒溫培養箱，循環水真空泵，721可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 總多糖、總皂苷提取流程

將黃芪、熟地、五味子、生曬參、麥冬原料在60℃的烘箱內烘干至恒重，將其粉碎。在不同的水浴溫度，回流提取時間，乙醇含量，料液比下進行提取。吸取部分提取液[9]，加入無水乙醇醇析得到粗多糖沉淀，然后用80%vol的乙醇洗滌沉淀，最后沉淀用水溶解并定容。另取部分提取液[10]，于蒸發皿內蒸發后，用水溶解，進行柱分離，收集洗脫液進行顯色實驗。

1.2.2 多糖含量的測定方法

本實驗采用苯酚-硫酸分光光度法測定總多糖含量。多糖經乙醇沉淀分離以后，去除其他可溶性糖及雜質的干擾，再與苯酚硫酸作用生成橙紅色化合物，其呈色強度與溶液中糖的濃度成正比，在490 nm波長下比色定量。

葡萄糖標準溶液的配制：精密稱取105℃干燥至恒重的對照葡萄糖25.0 mg,加水溶解,定容于250 mL容量瓶中,配制成葡萄糖對照溶液備用。精密吸取葡萄糖對照溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL置于20 mL的干燥試管中,依次加水使體積均為2.0 mL，另取2.0 mL蒸餾水作空白對照，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃H2SO45.0 mL，充分搖勻,室溫放置5 min，沸水浴加熱15 min，取出冷卻至室溫。在490 nm處測定其吸光度值[11]。

樣品處理：精密吸取一定量的經過脫蛋白處理定容的樣品液,以測定標準曲線同樣的方法測其吸光度值，繼而求出濃度。

1.2.3 總皂苷含量的測定方法

樣品中總皂苷經提取、D101大孔吸附樹脂柱預分離后，在酸性條件下，香草醛與人參皂苷生成有色化合物，以人參皂苷Re為對照品，于560 nm處比色測定。

標準溶液的配制：精密稱取10 mg人參皂苷Re，放入10 mL的容量瓶中，用甲醇溶液溶解并定容至刻度，得到濃度為0.50 mg/mL的標準品儲備液。精密取上述配好的儲備液30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、180 μL置于10 mL的比色管中，水浴蒸干甲醇后，加入8%香草醛乙醇試液0.5 mL，72%硫酸試液5 mL，充分振搖混勻后置于60℃恒溫水浴中加熱10 min，立即用冰水冷卻10 min，搖勻。以試劑做空白，在560 nm波長處測定吸光度[12]。

樣品處理：精密量取一定量經過柱分離的樣品液，按上述步驟進行實驗，在560 nm波長處測量吸光光度值。進而計算出樣品皂苷濃度。

2 結果和討論

2.1 總多糖結果的測定

在實驗條件下，以體積（mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標作圖，得標準曲線，見圖1。

計算公式：總多糖提取率（%）=c×V/m×100。

式中：c，從回歸方程中得出的多糖質量（mg）；V，待測樣體積倍數；m，中藥復合物總質量（mg）。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 總皂苷結果的測定

在實驗條件下，以體積（mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標作圖，得標準曲線，見圖2。

計算公式：總皂苷提取率（%）=c×V/m×100。

式中：c，從回歸方程中得出的皂苷質量（mg）；V，待測樣體積倍數；m，中藥復合物總質量（mg）。

圖2 人參皂苷Re標準曲線

2.3 勾兌型黃酒中功能性成分提取工藝優化

在前期預實驗的基礎上，分別考察水浴溫度、回流提取時間、乙醇含量、料液比4個因素對黃芪、熟地、五味子、生曬參、麥冬勾兌型黃酒提取工藝的影響，并以總多糖和總皂苷為主要檢測指標。

2.3.1 水浴溫度對總多糖和總皂苷的影響（圖3、圖4）

不同的水浴加熱溫度對黃芪、熟地、五味子、生曬參、麥冬中的多糖和皂苷的提取率有很大的影響。將料液比1∶20，乙醇含量20%的黃芪、熟地、五味子、生曬參、麥冬室溫下過夜浸泡后，改變水浴加熱溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，提取4 h后，測定總多糖和總皂苷含量，確定最佳水浴加熱溫度。測定結果表明，多糖濃度隨溫度升高而增加，70℃時，提取液中總多糖含量最高，濃度為36.40 mg/mL，但是隨著溫度的升高，多糖濃度反而降低，可能原因是溫度過高導致多糖降解；皂苷濃度隨溫度升高而增加，90℃時，提取液中總皂苷含量最高，濃度為4.93 mg/mL。

圖3 溫度對提取液總多糖含量的影響

圖4 溫度對提取液總皂苷含量的影響

2.3.2 回流提取時間對總多糖和總皂苷的影響（圖5、圖6）

原料室溫下過夜浸泡后進行熱水回流提取，水浴溫度60℃，乙醇含量20%，料液比1∶20，改變回流時間，設定為2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，測定結果：多糖濃度隨提取時間的延長而增加，5 h時最高，濃度為33.57 mg/mL，但是隨著時間的延長，多糖濃度反而降低；皂苷濃度在4 h時最高，濃度為4.81 mg/mL。

2.3.3 乙醇含量對總多糖和總皂苷的影響（圖7、圖8）

原料室溫下過夜浸泡后進行熱水回流提取，水浴溫度60℃，回流時間4 h，料液比1∶20，改變乙醇含量分別為10%、15%、20%、25%、30%，結果表明，多糖濃度在乙醇含量為15%vol時最高，濃度為38.13 mg/mL；皂苷濃度隨著乙醇含量的增加而降低，在乙醇含量為10%vol時皂苷濃度最高，為6.32 mg/mL。

圖5 回流提取時間對提取液總多糖含量的影響

圖6 回流提取時間對提取液總皂苷含量的影響

圖7 乙醇含量對提取液總多糖含量的影響

2.3.4 料液比對總多糖和總皂苷的影響（圖9、圖10）

圖8 乙醇含量對提取液總皂苷含量的影響

原料室溫下過夜浸泡后進行熱水回流提取，水浴溫度60℃，回流時間4 h，乙醇含量20%vol，改變料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30。結果表明，多糖提取率隨著料液比的增加而提高，料液比為1∶30時，多糖提取率最高，為53.52%；皂苷提取率隨著料液比的增加而提高，料液比為1∶25時，皂苷提取率最高，為10.85%。

圖9 料液比對提取液總多糖含量的影響

圖10 料液比對提取液總皂苷含量的影響

表1 正交實驗結果

2.4 提取總多糖和總皂苷的正交實驗

2.4.1 正交實驗設計的結果和分析

在上述實驗結果的基礎上，選取4因素3水平作正交實驗，因素水平及實驗結果計算及分析見表1。由極差（R）可知，以多糖為檢測指標，各因素影響次序分別為水浴溫度（A）＞乙醇含量（D）＞料液比（C）＞提取時間（B），最佳優化組合為A1B2C2D1。以總皂苷為檢測指標，各因素的影響次序分別為水浴溫度（A）＞料液比（C）＞乙醇含量（D）＞提取時間（B），最佳優化組合為A1B2C2D1。所以綜合考慮，提取的最佳工藝是水浴溫度70℃，提取時間5 h，乙醇含量10%vol，料液比1∶25。

表2 方差分析表

2.4.2 驗證實驗

根據正交實驗結果進行驗證實驗，以水浴溫度70℃，提取時間5 h，乙醇含量10%vol，料液比1∶25進行提取，測定總多糖的提取率為58.92%，總皂苷的提取率為11.20%。

3 結論

黃芪、熟地、五味子、生曬參、麥冬勾兌型保健黃酒的主要影響因素有水浴溫度、提取時間、乙醇含量、料液比。經單因素實驗、正交實驗和驗證實驗最終得出最佳提取工藝參數：水浴溫度70℃，提取時間5 h，乙醇含量10%vol，料液比1∶25，得到溶液的總多糖提取率為58.92%，總皂苷的提取率為11.20%。

[1] 張春梅.黃芪的現代藥理研究及其臨床應用[J].醫學信息,2016,29(7)：291-292.

[2] 艾志瓊,申元英,張態,等.黃芪對小鼠免疫功能影響的研究[J].軍醫進修學院學報,2010(8)：805-807.

[3] 夏慶華,路千里.熟地黃藥理研究進展[J].江西中醫學院學報,2008,20(6)：96-97.

[4] 李發勝,徐恒瑰,李明陽,等.熟地多糖提取物對小鼠免疫活性影響[J].中國公共衛生,2008,24(9)：1109-1110.

[5] 楊秀偉.人參化學成分研究的新進展[J].中國藥學雜志, 1985,20(8)：489-493.

[6] 張劍平,高燕菁,徐客沂,等.生曬參和紅參體外免疫增強的作用[J].細胞與分子免疫學雜志,2000,16(5)：387-388.

[7] 李靖文,周長林.多糖的免疫調節作用及多糖藥物的研究進展[J].中國生化藥物雜志,2016,36(4)：24-28.

[8] 李琴,李紅月,孫志偉.人參皂苷Rb1的藥理作用研究進展[J].信息化建設,2016,10：1233-1237.

[9] 劉穎,王文晞,姜紅.茯苓多糖及其分子量測定[J].中國現代應用藥學,2016(11)：1402-1405.

[10] 宋興良,李冰冰,高振珅.大蒜多糖及皂苷的多指標優化提取工藝研究[J].食品科技,2015(1)：216-219.

[11] 李惠,李立祥,陶濤,等.黃精中水浸出物、多糖和皂苷綜合提取工藝優化[J].食品與發酵工業,2011,37(10)：223-226.

[12] 馮俊,鄒鵬飛,雷武,等.黃芪多糖和皂苷綜合提取工藝研究[J].食品研究與開發,2016,37(2)：62-64.

Production of Healthcare Yellow Rice Wine by Blending with Astragalus membranaceus,Rehmannia glutinosa and Panax ginseng

XIE Dumei1,GAO Xiao1,ZHANG Lei1,ZHOU Jiandi2and JIANG Yujian1
（1.School of Food Science and Biotechnology,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou,Zhejiang 310018;
2.National Engineering Research Center for Yellow Rice Wine,Shaoxing,Zhejiang 312000,China）

In this study,Astragalus membranaceus,Rehmannia glutinosa,Schisandra chinensis,Panax ginseng and Ophiopogon japonicus were used as raw materials to produce healthcare yellow rice wine.The optimum extraction technology was determined to be hot reflux extraction.And the factors influencing the extraction were investigated by single factor test and orthogonal test with total polysaccharides and total saponins as the reference indexes.Finally,the best technical conditions were summed up as follows:water bath temperature at 70℃,reflux extraction time was 5 hours,ethanol content was 10%,and the ratio of raw materials to liquid was 1∶25.Under the above conditions,the total polysaccharide extraction rate was 58.92%and the total saponin extraction rate was 11.20%.

Astragalus membranaceus;Rehmannia glutinosa;healthcare yellow rice wine;polysaccharide;saponins;extraction optimization

TS262.4；TS261.4；TS262.91

A

1001-9286（2017）05-0083-05

10.13746/j.njkj.2017056

食品科學與工程浙江省重中之重一級學科開放基金項目（編號JYTSP20142082）。

2017-03-10

謝杜梅(1992-)，女，碩士。

蔣予箭，E-mail：13357180599@189.cn。

優先數字出版時間：2017-04-17；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170417.1022.005.html。