廣西毛葡萄及釀酒皮渣中齊墩果酸的分析研究

張 勁，黃小云，秦曉媛，謝太理，管敬喜，文仁德，謝林君，成 果

（1.廣西壯族自治區農業科學院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧530007；

2.廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西南寧530021）

廣西毛葡萄及釀酒皮渣中齊墩果酸的分析研究

張 勁1，黃小云1，秦曉媛2，謝太理1，管敬喜1，文仁德1，謝林君1，成 果1

（1.廣西壯族自治區農業科學院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧530007；

2.廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西南寧530021）

探索生理活性成分齊墩果酸在毛葡萄中的分布，考察利用毛葡萄釀酒皮渣提取齊墩果酸的可行性。以廣西毛葡萄及釀酒皮渣為實驗原料，采用高效液相色譜法（HPLC）分析毛葡萄果皮、葡萄籽、葡萄汁、葡萄酒及釀酒皮渣和釀酒葡萄籽中齊墩果酸的含量。結果表明，在毛葡萄果皮及釀酒皮渣中均檢出齊墩果酸，但在葡萄汁、葡萄酒及葡萄籽中未檢出。齊墩果酸天然存在于毛葡萄果皮中，由于其水不溶性，通過浸漬發酵無法溶入葡萄酒中。利用毛葡萄釀酒皮渣提取齊墩果酸為葡萄酒釀酒廢棄物綜合利用提供了新思路。

毛葡萄； 釀酒皮渣； 齊墩果酸

齊墩果酸（oleanolic acid,OA），又名慶四素，是一類五環三萜化合物，以游離態和糖苷鍵合形式廣泛存在于女貞子、連翹、景天三七、人參、雪膽、夏枯草等藥用植物中[1]，并且存在于木瓜[2]、葡萄[3]、大棗等食物中。據研究報道，OA具有護肝、解肝毒、降轉氨酶、降血糖、降血脂、抗炎抗病毒、抗突變、抗癌等多重藥理作用[1]。

近年來，對于葡萄中齊墩果酸的發現、含量測定以及分離提取的研究越來越多。研究發現，OA主要存在于葡萄皮中[4]，含量較高的葡萄品種多集中于新疆產地鮮食及釀酒葡萄品種，如索索葡萄[5]、和田紅、木訥格、無核白、馬奶子克里米札特、巨峰等[6]，另外，刺葡萄籽多酚提取物中也發現OA的存在[7]。目前，葡萄中齊墩果酸的研究領域多集中于含量測定[6]、提取工藝[8-9]及藥理作用[10-11]等方面。

毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd)是葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(Vitis L)真葡萄亞屬(E-uvitis)東亞種群的一個種，原產于中國，是我國葡萄屬東亞種群中分布最廣的一個野生種[12]。毛葡萄是廣西分布最廣的葡萄屬野生品種，含有豐富的維生素、氨基酸、不飽和脂肪酸、礦物質、雙糖苷花色苷、超氧化物歧化酶、白藜蘆醇等營養功效成分，食用或飲用葡萄酒具有抗衰老、軟化血管、抗癌等多重保健作用[13]。本研究首次探索生理活性物質齊墩果酸在廣西毛葡萄中的分布情況，探索利用毛葡萄釀酒皮渣提取齊墩果酸的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

毛葡萄：2016年8月采自廣西羅城，品種為“野釀2號”，由廣西農科院生物所鑒定。

毛葡萄酒及釀酒皮渣：由廣西農科院葡萄與葡萄酒研究所釀造工藝研究室利用野釀2號毛葡萄按照干紅釀造工藝發酵釀造干紅葡萄酒，在酒精發酵結束時分離釀酒皮渣（含葡萄籽）。

樣品前處理：取1 kg毛葡萄果實，人工去皮，分離葡萄籽，準確稱重，計算皮果比和籽果比；果肉經勻漿、離心（8000 r/min，10 min），取上清液果汁備用；葡萄皮和葡萄籽自然晾干，加液氮粉碎，經冷凍干燥（-58℃，24 h），計算得率，葡萄皮及葡萄籽干粉備用。

釀酒皮渣：稱取1 kg釀酒皮渣，分離皮渣與葡萄籽，60℃熱風干燥，粉碎，過100目篩，計算皮渣和葡萄籽得率，干粉備用。

試劑：齊墩果酸（HPLC），Sigma；甲醇（色譜級），Fisher；水為實驗室超純水。

儀器設備：高效液相色譜儀（LC-20AT），日本島津；高速離心機（TG16-WS），湖南湘儀；真空冷凍干燥機（Alpha 1-2 LDplus），德國Christ；超聲波清洗機（XUB25），Grant；電熱鼓風干燥箱，上海躍進。

1.2 實驗方法

1.2.1 OA的提取

葡萄皮、葡萄籽樣品：取經干燥的葡萄鮮果分離的葡萄皮、葡萄籽及釀酒后的葡萄皮渣和葡萄籽干粉，準確稱量1.0000 g，用甲醇定容至25 mL，超聲波提取30 min，常溫浸漬30 min，經高速離心（8000 r/min，10 min），取上清液1 mL，用甲醇定容至10 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液上機進行HPLC分析。

葡萄汁樣品：取澄清葡萄汁樣品，稀釋10倍，經0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液上機進行HPLC分析。

葡萄酒樣品：取葡萄酒樣品，稀釋50倍，經0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液上機進行HPLC分析。

1.2.2 OA的HPLC分析

色譜條件：島津InertSustainC18（250mm×4.6mm× 5 μm），流動相：甲醇∶水=85∶15（v/v），檢測器：UV檢測器，波長210 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

標準曲線繪制：準確稱取10 mg OA標準品，用甲醇定容至10 mL，配制成1 mg/mL的標準試劑母液，取母液配制成10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的標準品溶液，按照色譜條件進樣分析。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理

針對1.1中葡萄皮、葡萄籽、釀酒葡萄皮渣、釀酒葡萄籽樣品前處理各步驟的樣品得率進行計算，結果見表1。葡萄鮮果中葡萄皮、葡萄籽含量和釀酒皮渣中皮、籽含量用于評價釀酒皮渣綜合利用的可行性，樣品干燥得率用于最終計算鮮樣中齊墩果酸的含量。

2.2 OA線性關系考察

根據HPLC的分析結果，標準品在19.617 min出峰，色譜圖見圖1。以標準品濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，見圖2。標準曲線為：Y=5439.5X-1238，R2=0.9999，線性關系良好。

圖1 OA標準品HPLC色譜圖

表1 樣品前處理中葡萄皮、葡萄籽得率

圖2 OA標準曲線

2.3 OA測定結果

根據樣品的HPLC分析結果，樣品中OA出峰時間在19.6 min左右，根據樣品中OA的峰面積和標準曲線，計算各樣品中的OA含量，結果見表2。

結果表明，毛葡萄含有齊墩果酸，主要集中于葡萄皮中。葡萄中營養成分多存在于果肉中，如有機酸、氨基酸等，而生物活性成分多分布在果皮與籽中，如白藜蘆醇、黃酮、原花青素等。有研究[3，14]發現，齊墩果酸存在于葡萄皮中，與本研究的結論一致，但文獻中少有報道葡萄籽、葡萄汁及葡萄酒中的OA測定研究進展，本研究表明，毛葡萄中齊墩果酸存在且僅存在于葡萄皮中。報道[3-4]認為，國內OA含量較高的葡萄主要為新疆產地的品種，如索索葡萄、和田紅、木訥格、馬奶子等，而歐洲葡萄品種中含量很低。本研究結果表明，廣西毛葡萄富含齊墩果酸，且含量高于新疆產地葡萄。

表2 毛葡萄中齊墩果酸含量

從含量上分析，干樣品的釀酒葡萄皮渣中OA含量高于鮮葡萄皮中，由2.1中樣品前處理得率數據，釀酒葡萄皮渣得率為鮮葡萄皮的1/2左右，說明濕樣品中，鮮葡萄皮中OA含量仍高于釀酒葡萄皮渣中，這是因為釀酒葡萄皮渣中不僅含有葡萄皮，而且含有一定量的葡萄果肉（酒泥）。馬龍等[3，6]的研究認為，新疆產葡萄皮中OA含量在1%左右，且釀酒后的皮渣中OA含量高于新鮮葡萄皮，其同樣是用干樣品含量計。毛葡萄干紅葡萄酒釀造中，一般產生30%釀酒皮渣（含籽），根據2.1中得率計算，1 t毛葡萄釀造干紅葡萄酒產生的皮渣中在理論上含有778.7 g齊墩果酸，具備工業化提取利用價值。

從毛葡萄、葡萄酒及釀酒葡萄皮渣中OA存在分布分析，新鮮葡萄皮、釀酒葡萄皮渣中含有OA，而葡萄籽、葡萄汁及葡萄酒中均未檢出OA。結果表明，葡萄果實中的OA僅存在于葡萄皮中，且通過發酵浸漬OA無法富集進入葡萄酒中。OA為齊墩果酸烷型五環三萜化合物，不溶于水，可溶于乙醇、氯仿、丙酮[15]。葡萄酒的酒精度為12%vol左右，OA無法溶解。OA具有護肝、解肝毒等豐富的生理作用，然而僅存在于葡萄皮中，通過葡萄鮮食或飲用葡萄酒均無法攝入OA。利用發酵后的釀酒葡萄皮渣提取OA，為釀酒廢棄物的綜合利用提供了一條新的思路。

2.4 精密度實驗

分別精確稱取野釀2號葡萄皮粉末和釀酒葡萄皮渣樣品粉末1.0000 g，按照樣品提取和測定方法條件進行實驗，各平行6次。結果葡萄皮中齊墩果酸的平均含量為1.639 g/100 g，RSD為2.477%；釀酒葡萄皮渣中OA的平均含量為1.697 g/100 g，RSD為4.310%。表明該實驗提取和測定方法精密度良好。

2.5 穩定性實驗

精確稱取野釀2號葡萄皮粉末1.0000 g，按照樣品提取和測定方法進行實驗，在0～12 h，每1 h進樣分析一次，記錄峰面積，計算測定結果。結果表明12 h內OA峰面積無明顯變化，13次樣品測試，OA平均含量為1.629 g/100 g，RSD為0.334%，說明樣品提取的OA測定穩定性良好。

2.6 回收率實驗

精確稱取野釀2號葡萄皮粉末1.0000 g共9份，分為3組平行，每組分別加入10 mg/mL的OA標準品試劑母液1 mL、2 mL、3 mL，每組平行3份，按照樣品提取和測定方法實驗，9次實驗結果表明，OA平均回收率為103.06%，RSD為1.41%。表明本實驗方法回收率高，可以滿足分析要求。

3 結論

本研究用HPLC法測定了廣西毛葡萄中葡萄皮、葡萄籽、葡萄汁、葡萄酒及釀酒葡萄皮、釀酒葡萄籽等樣品中的齊墩果酸含量。葡萄果實僅葡萄皮中存在齊墩果酸，葡萄汁和葡萄籽中均不含有齊墩果酸，且通過發酵浸漬，齊墩果酸無法溶入葡萄酒中。釀酒后的葡萄皮渣中富含齊墩果酸，具備提取利用的價值。本研究團隊今后將就毛葡萄皮渣齊墩果酸綜合利用和齊墩果酸功能型葡萄酒為研發方向繼續深入研究。

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Analysis of Oleanolic Acid in Vitis quinquangularis Rehd and Its Skin Residues after Wine Making

ZHANG Jin1,HUANG Xiaoyun1,QIN Xiaoyuan2,XIE Taili1,GUAN Jingxi1, WEN Rende1,XIE Linjun1and CHENG Guo1
(1.Viticulture and Wine Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning,Guangxi 530007;
2.Guangxi&ASEAN Inspection&Testing Center For Food and Drug Safety,Nanning,Guangxi 530021,China)

The distribution of biologically-active component oleanolic acid in Guangxi V.quinquangularis Rehd was explored and the feasibility of extracting oleanolic acid from V.quinquangularis Rehd skin residues after wine making was discussed.V.quinquangularis Rehd and its skin residues were used as the experimental raw materials,and oleanolic acid content in V.quinquangularis Rehd skin,seed,juice,wine and skin residues was measured by HPLC.The results showed that,oleanolic acid was detected in fresh fruit skin and skin residues,but not in seed,juice and wine.As a conclusion,oleanolic acid naturally exists in V.quinquangularis Rehd skin and it could not dissolve in wine due to its water-insoluble property.The extraction of oleanolic acid from skin residues was feasible and it was a new pathway for comprehensive utilization of grape pomace.

Vitis quinquangularis Rehd;skin residues;oleanolic acid

TS261.2；TS261.9；TS261.7

A

1001-9286（2017）05-0099-04

10.13746/j.njkj.2017010

廣西農業科學院基本科研業務專項（桂農科2015YM05、桂農科2015YT85和桂農科2015JZ150），廣西自然科學基金（2015GXNSFBA139091）。

2017-01-16

張勁（1986-），男，助理研究員，碩士，研究方向為農產品加工及貯藏，E-mail：86562900@qq.com。

成果（1987-），女，助理研究員，博士，研究方向為釀酒葡萄生理代謝，E-mail：berry713@163.com。

優先數字出版時間：2017-04-17；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170417.1001.002.html。