超高效液相色譜法測定新疆巴旦木中黃曲霉毒素B1不確定度評定

郭金喜，遠 輝

(1.新疆維吾爾自治區產品質量監督檢驗研究院，新疆烏魯木齊830011；2.國家農副產品質量監督檢驗中心，新疆烏魯木齊830011)

超高效液相色譜法測定新疆巴旦木中黃曲霉毒素B1不確定度評定

郭金喜1，2，遠 輝1，2

(1.新疆維吾爾自治區產品質量監督檢驗研究院，新疆烏魯木齊830011；2.國家農副產品質量監督檢驗中心，新疆烏魯木齊830011)

對超高效液相色譜法測定新疆巴旦木中黃曲霉毒素B1的含量進行不確定度評定，為建立有效的質量控制方法提供參考。依據CNAS—GL06《化學分析中不確定度的評估指南》和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，建立了數學模型，分析了超高效液相色譜法測定新疆巴旦木中黃曲霉毒素B1不確定度來源，并對數學模型中各不確定度分量的來源進行分析、量化和合成，得出黃曲霉毒素B1的擴展不確定度。結果表明，影響測量結果不確定度的主要因素為樣品稱量、溶液體積、最小二乘法標準曲線擬合、樣品回收率等。本實驗的不確定度為1.06 μg/kg。

超高效液相色譜； 巴旦木； 黃曲霉毒素B1； 不確定度

黃曲霉毒素是黃曲霉菌的次級代謝產物，其中對人體最具威脅的是具致癌性的黃曲霉毒素B1，主要作用于肝臟，產生致癌、致畸、致突變等嚴重危害[1]。目前，世界各國和地區對食品中黃曲霉毒素均有明確的限量要求[2-3]。我國食品安全標準中規定，巴旦木中黃曲霉毒素B1的限量為5.0 μg/kg。巴旦木是食用價值很高的新疆特產，富含脂肪、蛋白質、淀粉、糖，以及少量維生素和人體不可缺少的18種微量元素，是新疆特有的堅果及堅果制品的重要原料[4-6]。本研究依據CNAS—GL06《化學分析中不確定度的評估指南》和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》規定的方法[7-8]，建立了數學模型，分析了超高效液相色譜法測定新疆巴旦木中黃曲霉毒素B1不確定度來源，并對各個不確定分量進行了量化處理，得出新疆巴旦木中黃曲霉毒素B1的擴展不確定度，為測定新疆黃曲霉毒素B1的質量控制提供一定的依據[9-11]。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

樣品：某企業提供新疆巴旦木。

儀器與試劑：2695高效液相色譜儀Waters公司；黃曲霉毒素免疫親和柱（北京中檢維康公司）；黃曲霉毒素B1標準品(Sigma公司），1.055 μg/mL，誤差范圍±0.002 μg/mL；甲醇(色譜純)，美國J.T. Baker；其他試劑均為分析純。

1.2 檢測方法

按照GB/T 18979—2003《食品中黃曲霉毒素的測定 免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法》中HPLC法，準確稱取試樣25.00 g，加入5 g氯化鈉及（7+3）甲醇水125 mL，以均質器高速攪拌提取2 min。將免疫親和柱放于固相萃取儀上，準確移取15 mL濾液注入免疫親和柱中，調節壓力以6 mL/min的流速過免疫親和柱，直至2～3 mL空氣通過柱體。準確加入1 mL色譜甲醇洗脫，流速為1～2 mL/min，收集全部流出液于樣品瓶中，供測試使用。經反相色譜柱分離后，測定黃曲霉毒素B1含量，根據保留時間和峰面積進行定性和定量[12-13]。

1.3 數學模型建立

1.3.1 數學模型

不確定度的計算，首先要明確被測值計算的數學模型，從而分析其可能的不確定來源。只有當影響被測值不確定度的基本因素都被考慮在內，所得到的各自的相對不確定度值才可以在整個計算中被采納[14-15]。本實驗中黃曲霉毒素B1含量計算數學模型為：

式中：X——試樣中黃曲霉毒素B1的含量，μg/kg；

m——試樣質量，g；

V1——樣品提取液總體積，125 mL；

V2——免疫親和柱上樣體積，15 mL；

V3——樣品定容體積，1 mL；

c——進樣體積中黃曲霉毒素B1的濃度，ng/mL；

f——回收率。

1.3.2 不確定度分量的主要來源及其分析

該方法前處理過程主要為手工操作，受人為因素影響較大。根據檢測方法和實際操作情況，高效液相色譜法測定黃曲霉毒素B1不確定度主要有以下幾個來源：一是樣品稱量引入的不確定度；二是樣品前處理、定容時溶液體積帶來的影響；三是最小二乘法標準曲線擬合產生質量濃度（c）的不確定度；四是回收率帶來的不確定度[16]。

2 不確定度分量

2.1 樣品稱量質量m的不確定度

標準要求稱樣質量為25.00 g，JJG 539—1997《數字指示秤》規定，該準確級的天平最大允許誤差為±0.005 g，按矩形分布原則，稱樣時由天平的最大允許誤差導致的樣品質量不確定度為：

2.2 溶液體積的不確定度

該不確定度由3個部分構成：一是樣品提取液體積（V1）所帶來的不確定度；二是由免疫親和柱上樣體積(V2)引入的不確定度；三是樣品定容體積（V3）產生的不確定度[17-18]。

2.2.1 樣品提取液體積V1的不確定度

樣品提取液使用250 mL量筒量取（7+3）甲醇水125 mL，JJG 196—2006《常用玻璃量器》規定：20℃時250 mL量筒的容量允許誤差為±1 mL，按矩形分布，則量筒量取提取液體積引入的不確定度分量為：

2.2.2 免疫親和柱上樣體積(V2)的不確定度

使用15 mL單標移液管準確吸取15 mL提取液進行免疫親和柱法，JJG 196—2006《常用玻璃量器》規定：20℃時15 mL單標移液管（A級）的容量允許誤差為±0.025 mL，按矩形分布，則免疫親和柱上樣體積引入的不確定度分量為：

2.2.3 樣品定容體積（V3）的不確定度

樣品最終定容使用1 mL單標線移液管移取色譜級甲醇進行定容，JJG196—2006《常用玻璃量器》規定：20℃時1 mL單標線移液管（B級）的容量允許誤差為±0.015 mL，按矩形分布，則單標線吸量管定容引入的不確定度分量為：

2.3 最小二乘法標準曲線擬合帶來的黃曲霉毒素B1質量濃度（c）的不確定度

配制出質量濃度為5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL共5個校準標準溶液，在高效液相色譜儀上測得的峰面積見表1。測得巴旦木中黃曲霉毒素B1的峰面積，然后由校準曲線計算黃曲霉毒素B1的質量濃度c，在采用最小二乘法擬合校準曲線時，計算得到的前處理液中黃曲霉毒素B1的質量濃度c的不確定度僅與峰面積的測量不確定度有關[19-20]。

對5個校準標準溶液各測量3次，共計15次。測量得到的色譜峰面積A見表1。

表1 校準標準溶液的峰面積測定結果

擬合校準曲線的方程為：

式中：Ai——色譜峰面積；

ρi——校準標準溶液黃曲霉毒素B1的質量濃度；

B0——擬合校準曲線的截距；

B1——擬合校準曲線的斜率。

由下式可得B0和B1分別為：

由下式可得色譜峰面積測量的實驗標準差為：

對待測樣品巴旦木共測量6次，即p=10。測得樣品處理液中黃曲霉毒素B1的含量為c=24.3 ng/mL。于是其標準不確定度u(c)為：

2.4 回收率（f）的不確定度

如前所述，該方法測定黃曲霉毒素B1，需經樣品的稱量、提取、凈化、淋洗、定容等步驟后再進行儀器分析測試。在該過程中，每一步的操作都會引入誤差，要逐步分析其對總不確定度的貢獻是相當困難的，結合實際工作認為，可用檢測過程中的有關數據如回收率統一評定不確定度。本實驗對樣品進行10次平行測試，根據10次結果進行計算，回收率結果見表2。

表2 回收率結果統計

按JJF 1059.1—2012中4.1方法，由貝塞爾公式計算得出單次測量實驗標準偏差：

3 測量不確定分量匯總表（表3）

表3 測量不確定分量匯總表

4 合成標準不確定度

試樣中黃曲霉毒素B1含量的平均值為X= 3.10 μg/kg，最后得到uc(X)=ucrel(X)×X=0.066×8.10= 0.53 μg/kg。

5 擴展不確定度

取包含因子K為2，擴展不確定度U(X)=0.53× 2=1.06 μg/kg。

6 不確定度報告

試樣中黃曲霉毒素B1含量為3.10 μg/kg，標準要求保留小數點后2位，所以新疆巴旦木中黃曲霉毒素B1含量不確定度報告為：3.10 μg/kg± 1.06 μg/kg，包含因子K=2。

7 結論

本研究以新疆巴旦木中黃曲霉毒素B1的10次取樣測定數據為基礎，進行了免疫親和層洗凈化超高效液相色譜法測定黃曲霉毒素的不確定度評定。由此發現，影響方法不確定度的主要因素來源于回收率引入的不確定度，其次是樣品最小二乘法標準曲線擬合帶來的黃曲霉毒素B1質量濃度的影響，而樣品量取等引入的不確定度可忽略不計。因此，在同等實驗操作條件下，選用性能穩定的免疫親和凈化柱和科學準確的取樣方法是保證黃曲霉毒素B1測定結果準確性的前提。在測試過程中可以從減小主要不確定度的來源進行改進，進而降低測量不確定度，使測試的準確率提高。

一切測試結果都不可避免地產生不確定度，測試結果的可靠性取決于不確定度的大小，只有出具不確定度值，檢測結果才完整而有意義。在本檢測實例中，黃曲霉毒素B1平均測試結果為3.10 μg/kg，擴展不確定度結果為1.06 μg/kg。黃曲霉毒素B1的濃度為4.16 μg/kg，均未超過國標限量值5.0 μg/kg。可作為新疆巴旦木生產企業在生產過程中的技術指標，為更好地把控生產質量提供質量參考依據。

[1] 李瑞芳,韓北忠,陳晶瑜,等.黃曲霉生長預測模型的建立及其在玉米儲藏中的應用[J].中國糧油學報,2008,23 (3)：144-147.

[2] 羅小虎,王韌,王莉,等.黃曲霉毒素檢測方法研究進展[J].糧食與飼料工業,2013(10)：54-58.

[3] 許艷麗,鮑蕾,梁成珠,等.黃曲霉毒素檢測及其生物防治方法的研究進展[J].安徽農業科學,2007,35(32)：10210-10212.

[4] 中國輕工業聯合會.葡萄酒、果酒通用分析方法：GB/T 15038—2006[S].北京：中國標準出版社,2008：21-23.

[5] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.食品添加劑衛生標準：GB 2760—2014[S].北京：中國標準出版社, 2015.

[6] 袁輝,王建玲,遠輝.超高效液相色譜發測定葡萄酒中檸檬酸含量的不確定度評定[J].釀酒科技,2014(5)：33-36.

[7] 韋昌聯,盧柳忠,黎貞崇.我國木薯生物質能源產業發展現狀與科技需求[J].釀酒科技,2012(7)：108-111.

[8] 全國認證認可標準化技術委員會.實驗室質量控制規范食品理化檢測：GB/T 27404—2008[S].北京：中國標準出版社,2008.

[9]田瑞紅,孫建平.HPLC技術分析測定黃曲霉毒素的研究進展[J].食品研究與開發,2015,36(6)：149-152.

[10] 郭禮強,宮小明,孫軍,等.高效液相色譜-質譜法同時測定曲霉菌代謝物中的黃曲霉毒素及其同系物[J]分析試驗室,2015,34(6)：677-682.

[11] 張燕,閆磊,戴洋洋,等.葡萄酒中檸檬酸的液相色譜檢測[J].食品研究與開發,2012,33(6)：125-127.

[12] 宋衛得,厲雪芹,高堯華,等.高效液相色譜法測定木薯干中黃曲霉毒素B1的不確定度評定[J].釀酒科技,2015 (4)：120-125.

[13] 國家糧食局.小麥粉與大米粉及其制品中甲醛次硫酸氫鈉含量的測定：GB/T 21126—2007[S].北京：中國標準出版社,2008.

[14] 于洋,徐春祥,車文軍.高效液相色譜法測定奶粉中的三聚氰胺及其不確定度分析[J].食品科學,2010,31(4)：250-253.

[15] 鄭懷東,劉學光,關麗.氣相色譜法測定河蟹中多氯聯苯殘留量的不確定度分析[J].食品科學,2011,32(16)：334-337.

[16] 張素娟.氣相色譜法測定白酒中乙酸乙酯含量的不確定度分析[J].食品科學,2010,31(2)：151-153.

[17] 張雪波,肖世青,杜先鋒,等.基于主成分分析法的安溪鐵觀音香氣質量評價模型的構建[J].食品科學,2012,33 (22)：225-230.

[18] 王旭,龔媛,張同剛,等.基于主成分分析法羊肉火腿香氣質量評價模型的構建[J].食品工業科技,2015(21)：122-127.

[19] 韓興林,潘學森,劉民萬,等.云門醬香型白酒風味特征的分析研究[J].釀酒科技,2014(10)：6-8.

[20] 楊春霞,廖永紅,劉峻雄,等.牛欄山二鍋頭酒醅中芽孢桿菌分離鑒定及發酵風味分析[J].食品工業科技,2012 (9)：69-74.

Evaluation of the Uncertainties in the Determination of Aflatoxin B1in Almond by Ultra Performance Liquid Chromatography

GUO Jinxi1,2and YUAN Hui1,2
(1.Xinjiang Product Quality Supervision and Inspection Institute,Urumqi,Xinjiang 830011;2.National Quality Supervision and Inspection Center ofAgricultural By-products,Urumqi,Xinjiang 830011,China)

The uncertainties in the determination of aflatoxin B1in almond by UPLC were evaluated to provide useful reference for establishing effective quality control methods.According to standards CNAS—GL06 and JJF 1059.1—1999,a mathematical model had been established to assess the uncertainty sources in the determination of aflatoxin B1in almond.Besides,the source of each uncertainty component was analyzed,quantified and synthesized.Finally,the expanding uncertainties were obtained.The results showed that the main factors influencing the uncertainty included sample dilution,sample weighting,curve fitting in the least-squares sense,and sample recovery rates,etc.The uncertainty of this experiment was 1.06 μg/kg.

ultra-performance liquid chromatography;almond;aflatoxin B1;uncertainty

O657.72；TS261.7

A

1001-9286（2017）05-0117-04

10.13746/j.njkj.2016379

2016-12-28

郭金喜（1981-），碩士，工程師。

優先數字出版時間：2017-02-13；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170213.1355.009.html。