B7-H3和Smad7蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及臨床意義

李貞 趙衛星

(新鄉醫學院基礎醫學院病理學教研室 河南 新鄉 453003)

B7-H3和Smad7蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及臨床意義

李貞 趙衛星

(新鄉醫學院基礎醫學院病理學教研室 河南 新鄉 453003)

目的 探討B7-H3和Smad7蛋白在食管鱗狀細胞癌(ESCC)組織中的表達水平及臨床意義。方法 收集82例ESCC組織標本及其癌旁正常組織石蠟標本，運用免疫組織化學方法檢測B7-H3及Smad7蛋白的表達。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測組織中B7-H3 mRNA 的表達水平。結果 B7-H3在ESCC組織中的表達陽性率高于癌旁正常組織，Smad7蛋白表達陽性率低于癌旁正常組織(P<0.05)。ESCC組織中B7-H3和Smad7蛋白的表達呈負相關(rs=-0.294，P=0.005)。ESCC組織中B7-H3蛋白表達與臨床分期、分化程度有關(P<0.05)，Smad7蛋白表達與分化程度有關(P<0.05)。結論 ESCC組織中B7-H3蛋白表達上調，Smad7蛋白表達下調。B7-H3和Smad7蛋白的異常表達可能參與了ESCC的發生發展過程。

食管鱗狀細胞癌； B7-H3蛋白；Smad7蛋白

食管癌屬于常見惡性腫瘤之一，居腫瘤相關疾病死亡原因的第6位，主要病理類型包括鱗癌、腺癌。我國主要以鱗癌為主，分布變異較大，河南、山西等省份為高發區。目前，食管癌的早期發現率、診斷率仍較低，臨床診斷多為中晚期患者，5年生存率僅為20%[1]。因此，深入了解食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell cancer，ESCC)的發病機制及疾病進展，對ESCC的早期診斷、治療、延長患者生存時間具有重要作用。B7-H3是免疫相關蛋白B7家族的成員，由316個氨基酸組成，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，在獲得性免疫反應中作為第二信使發揮作用[2]。TGF-β通路是其免疫反應中重要的調控因素之一，Smad7為該通路的主要蛋白[3]。研究發現，B7-H3在結腸癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤中高表達，并且可能與腫瘤預后相關[4]。本研究主要研究B7-H3和Smad7在ESCC中的表達并探討其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 材料 82例新鮮食管癌組織及對應癌旁正常組織標本取自于2011年8月至2016年12月在鄭州大學第一附屬醫院行食管癌根治術治療的ESCC患者。標本采集后立即放無RNA酶的EP管中，-80 ℃冰箱保存。分別根據WHO病理分級標準、國際TNM分期標準進行組織學分級及臨床分期。其中男50例，女32例，年齡39～72歲，平均(59.86±5.8)歲；伴周圍淋巴結轉移61例，無周圍淋巴結轉移21例；中、低分化54例，高分化28例。TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期28 例，Ⅲ、Ⅳ期54例。所有患者均接受手術治療且術后病理證實為ESCC，術前均未接受任何抗癌治療。標本分別在癌組織、癌旁正常組織(取自手術切緣或癌組織邊緣5 cm以外)2個部位取材，均經HE染色病理診斷證實。

1.2 RNA提取、反轉錄及qRT-PCR 首先根據Trizol試劑說明書提取癌組織及癌旁組織總RNA，然后將RNA逆轉錄為cDNA。實驗以β-actin為內參。B7-H3上游引物：5’-AGC ACT GTG GTT TGG TAT CTG TCA G-3’；下游引物：5’-CAC CAG CTG TTT GGT ATC TGT CAG-3’。β-actin上游引物：5’-GGT GTG ATG GTGGGT ATG GGT-3’；下游引物：5’-CTG GGT CAT CTT TTC ACG GT-3’。反應條件： 95 ℃預變性1 min，然后擴增40個循環，每個循環包括95 ℃、5 s，60 ℃、30 s。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。用SDS(2.4版)進行熒光數據分析，數據分析采用比較Ct(ΔΔCt)值的方法。

1.3 采用免疫組化SP法檢測B7-H3和Smad7蛋白的表達 兔抗人B7-H3多克隆抗體(1∶100)、兔抗人Smad7多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司SP試劑盒和DAB 顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。癌組織和癌旁正常組織脫水常規處理后，滴加經PBS液稀釋的一抗、二抗及辣根過氧化物酶鏈霉卵白素液，DAB顯色工作液進行顯色，蘇核復染脫水、透明、封片，于鏡下觀察。B7-H3和Smad7蛋白在ESCC中的著色都主要定位于胞質，陽性顆粒為棕黃色。隨機挑選每張切片中的5個高倍視野，于每個視野中計數100個細胞，得到陽性細胞所占百分比。所有切片結果的判讀均由兩位高年資有經驗的病理學老師指導。

1.4 統計學處理 全部數據應用SPSS 18.0軟件進行處理。采用配對χ2檢驗比較B7-H3、Smad7在ESCC和正常食管黏膜組織中陽性表達率的差異；采用χ2檢驗比較B7-H3和Smad7蛋白在ESCC組織中表達與臨床病理各變量間的關系；采用Spearman相關性分析對ESCC組織中兩指標的關聯性進行分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ESCC和癌旁正常組織中B7-H3和Smad7蛋白的表達情況 ESCC和癌旁正常組織中B7-H3和Smad7蛋白的表達情況見圖1。B7-H3在ESCC組織中的表達陽性率高于癌旁正常組織，Smad7蛋白表達陽性率低于癌旁正常組織(P<0.05)。見表1。

A：B7-H3在ESCC中陽性表達(400×)；B：Smad7在ESCC中陰性表達(400×)；C：B7-H3在癌旁正常組織中陰性表達(400×)；D：Smad7在癌旁正常組織中陽性表達(400×)。

圖1 B7-H3和Smad7蛋白在食管癌組織中的表達

2.2 B7-H3 mRNA相對表達水平 B7-H3 mRNA在ESCC中的相對表達水平高于癌旁正常組織(P<0.05)。見圖2。

圖2 B7-H3在ESCC和癌旁正常組織中的相對表達水平

2.3 ESCC組織中B7-H3和Smad7蛋白表達的相關性 ESCC組織中B7-H3和Smad7蛋白的表達呈負相關(rs=-0.294，P=0.005)。見表2。

表2 ESCC組織中B7-H3和Smad7蛋白表達的相關性

2.4 B7-H3和Smad7蛋白表達與ESCC分化及臨床特征的關系 ESCC組織中B7-H3蛋白表達與臨床分期、分化程度有關(P<0.05)，Smad7蛋白表達與分化程度有關(P<0.05)。見表3。

表3 B7-H3和Smad7蛋白表達與ESCC分化及臨床分級的關系[n(%)]

3 討論

食管癌惡性程度較高，臨床發現的多為中晚期患者[5]。腫瘤的形成和多種原因有關，包括易感基因、生活環境、誘導因素等[6]。淋巴細胞在腫瘤免疫中發揮重要作用，主要受組織相容性抗原和共刺激分子的調節。B7-H3是一種跨膜糖蛋白，可接受共刺激分子的調節，引起下游通路的激活或抑制，作用于T細胞，在腫瘤微環境中抑制T細胞的活化、多種細胞因子的合成，利于腫瘤的增生。B7-H3的異常表達與肺癌、前列腺癌、肝癌等多種腫瘤相關[4]。

研究表明，B7-H3在腫瘤組織中通過上調TLR4的表達，進一步導致NF-κB通路的激活，而NF-κB的激活發揮正反饋作用，上調B7-H3在腫瘤組織中的表達，并且與腫瘤新生血管的形成密切相關，促進癌組織的轉移[7]。所以在腫瘤組織中，B7-H3的表達水平是升高的。TGF-β信號通路主要與EMT有關，涉及多種Smad蛋白，如Smad2、Smad4，通過與TGF-β受體結合以轉錄復合物，從細胞質進入細胞核，參與遺傳物質的調控，產生抑制細胞生長、誘導細胞發生上皮細胞-間充質轉化(EMT)的效應，而TGF-β信號通路可通過TAK1促進NF-κB信號通路的激活[8]。TGF-β和NF-κB的激活促進Smad7的表達，而Smad7在該通路中發揮負反饋作用，是一種負調控因子，具有抑癌作用。在癌組織中，由于這種相互作用，致癌因子增多，抑癌因子減少，Smad7表達水平降低，促進了腫瘤細胞的增生及轉移[9]。

本研究運用免疫組化方法測定ESCC組織及癌旁正常組織中B7-H3和Smad7蛋白的表達，結果顯示ESCC組織中B7-H3蛋白的表達水平升高(P<0.05)，Smad7蛋白的表達降低(P<0.05)，ESCC組織中B7-H3和Smad7蛋白的表達呈負相關；ESCC組織中B7-H3蛋白表達與臨床分期、分化程度有關(P<0.05)，Smad7蛋白表達與分化程度有關(P<0.05)。由該結果可推測，B7-H3促進NF-κB信號通路的激活，通過TGF-β信號通路的相互作用，進而導致Smad7水平降低，誘發EMT，促進腫瘤的發生，并且參與腫瘤的發生、進展、轉移。腫瘤的形成是多因素導致的，需要進一步研究其發生原因。因此，深入研究ESCC中各種分子及信號通路的作用機制，有利于更好地預防腫瘤的發生，為治療方案的改進以及預后評估提供參考。

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Expression of B7-H3 and Smad7 protein in esophageal squamous cell carcinoma tissue and the clinical significance

Li Zhen, Zhao Weixing

(PathologyTeachingSection,BasicMedicalCollege,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China)

Objective To explore the expression of B7-H3 and Smad7 protein in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) tissue and the clinical significance. Methods Eighty-two cases of ESCC tissues and adjacent normal tissues were selected and the expression of B7-H3 and Smad7 protein were detected by immunohistochemistry. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression level of mRNA B7-H3 in ESCC tissues and adjacent normal tissues. Results Positive expression rate of B7-H3 protein in ESCC tissues was significantly higher than the adjacent normal tissues (P<0.05), and the positive expression rate of Smad7 protein was lower than the adjacent normal tissues (P<0.05). The expression of B7-H3 protein was negatively correlated with Smad7 protein in ESCC tissues (rs=-0.294,P=0.005). Expression of B7-H3 protein was significantly related to clinic staging and differentiation grade (P<0.05), and the expression of Smad7 protein was significantly related to differentiation grade (P<0.05). Conclusion Expression of B7-H3 protein was up-regulated and expression of Smad7 protein was down-regulated in ESCC tissues. The abnormal expression of B7-H3 and Smad7 protein may be involved in the occurrence and development of ESCC.

Esophageal squamous cell carcinoma; B7-H3 protein; Smad7 protein

趙衛星，E-mail：zwx9@xxmu.cdu.cn。

R 735.1

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.06.005

2017-02-12)