川芎嗪阻滯細胞周期抑制MCF-7細胞增殖的初步研究①

宋慶嬌，柳朝陽，王 迪，王維銘，楊 瑩, 劉璐，張 濤

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007 )

川芎嗪阻滯細胞周期抑制MCF-7細胞增殖的初步研究①

宋慶嬌，柳朝陽，王 迪，王維銘，楊 瑩, 劉璐，張 濤

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007 )

目的：探討川芎嗪阻滯細胞周期抑制細胞增殖抗乳腺癌機制。方法：MTT法檢測川芎嗪對MCF-7細胞增殖抑制作用;PI單染法流式細胞術檢測川芎嗪作用MCF-7細胞細胞周期分布。結果：不同濃度的川芎嗪作用MCF-7細胞24h、48h和72h可對MCF-7細胞的增殖產生直接抑制作用， 呈時間和劑量依賴性; 不同濃度的川芎嗪作用MCF-7細胞48h，川芎嗪誘導MCF-7細胞停滯于G1期，呈量效關系。結論：川芎嗪可通過誘導細胞周期阻滯抑制MCF-7細胞增殖。

川芎嗪; 細胞周期; 細胞增殖

乳腺癌的發病率全世界居女性惡性腫瘤之首。探討中藥防治乳腺癌機制是我國乳腺癌研究的重要任務。本研究以人乳腺癌細胞MCF-7為研究對象，觀察川芎嗪對MCF-7細胞細胞周期和細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞株、藥品和試劑

中國醫學科學院腫瘤研究所購買人乳腺癌MCF-7細胞。噻唑藍(MTT)、 胎牛血清、DMEM培養基、青鏈霉素、胰蛋白酶和細胞周期檢測試劑盒購于Sigma公司，川芎嗪購于北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1MTT法檢測川芎嗪對MCF-7細胞的生長抑制作用

胰酶消化MCF-7細胞(對數生長期)，制備2×105單細胞懸液接種培養24h后分別加入濃度為(0.25、0.5、1.0、2.0和4.0)mg/mL的川芎嗪，control組：無藥物，有細胞與DMEM培養基和0.05%DMSO，在加藥后的24h、48h和72h時分別取出培養板，MTT溶液10μL加入，37℃4h后，明顯的藍紫色顆粒結晶在陰性對照組中形成時，每孔加入150μLDMSO。570nm波長檢測每孔吸光度值(Absorbance，A值)。

計算細胞生長抑制率=(1-實驗組平均A值/對照組平均A值)×100%。

1.2.2 流式細胞術檢測川芎嗪對MCF-7細胞周期的影響

取對數生長期的MCF-7細胞，分別加入濃度為(0.25、0.5、1.0、2.0和4.0)mg/mL的川芎嗪，control組：有細胞、DMEM培養基、0.05DMSO，無藥物，培養48h后用胰酶消化成單細胞懸液。

PI單染法檢測細胞周期：每組取l×106個細胞，冰乙醇固定，4℃冰箱過夜，離心棄上清，PBS重懸2次，離心。固定細胞用PI溶液染色。暗箱培養1h。

細胞被熒光標記在流式細胞儀分選。用Multicycle軟件分析細胞周期中不同階段的細胞數目。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 川芎嗪對MCF-7細胞的生長抑制作用

MTT檢測結果：與control組比，川芎嗪的不用濃度(0.25、0.5、1.0、2.0和4.0)mg/mL，24h、48h和72h分別作用MCF-7細胞，0.5mg/mL48h和72h細胞抑制率有顯著差異(P<0.05，P<0.01)見表1。2.0mg/mL和4.0mg/mL的川芎嗪在48h細胞抑制率比較有顯著差異(P<0.05)； 1.0mg/mL、2.0mg/mL和 4.0mg/mL的川芎嗪在48h與72h相比，細胞抑制率有顯著差異(P<0.05),見表1。川芎嗪作用MCF-7細胞，可直接抑制MCF-7增殖，呈時間依賴性和劑量依賴性。

表1 川芎嗪對MCF-7細胞生長抑制作用±s)

與control組相比，*P<0.05,**P<0.01；與0.5mg/mL組相比，★P<0.05；與48h組相比，#P<0.05。

2.2 川芎嗪對MCF-7細胞周期的影響

細胞周期結果顯示：川芎嗪(0.25、0.5、1.0、2.0和4.0)mg/mL作用MCF-7細胞48小時，與對照組(42.43%)相比，G0/G1期細胞所占百分比從47.32%隨濃度遞增依次增加至52.83%、59.60%、69.65%和80.11%，除0.25mg/mL外，G0/G1期百分率細胞遞增，呈劑量依賴性(P<0.05，P<0.01)，G2/M期和S期細胞減少(見表2)，以上表明川芎嗪作用MCF-7細胞，可以使細胞發生G0/G1期阻滯。

表2 川芎嗪對MCF-7細胞周期分布的影響

與control組相比，*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

腫瘤細胞與正常細胞的區別是細胞不斷增殖，因此，治療惡性腫瘤的主要手段是抑制細胞增殖是。中藥川芎萃取出來的單體生物堿川芎嗪，可以對微循環進行改善、對血液凝集進行抑制、擴血管等生物作用[1]。文獻報道川芎嗪具有抗黑色素瘤、白血病、胃癌等作用[2，3]。

本研究表明，川芎嗪呈時間和劑量依賴性的對MCF-7細胞具有直接抑制增殖作用。 細胞增殖過程必須經歷細胞周期，細胞周期可以分為G1期，S期，G2期和M期四個時期，在G1期細胞生物合成蛋白質和RNA，DNA分子的復制在S期進行。因為G2期是為M期的有絲分裂做準備，在這一期為保證準確復制DNA，進行必要的檢查及修復。M期是分裂期，完成細胞分裂，在這一期平均分配遺傳物質到子細胞中。 失去控制的增值生長作為腫瘤細胞的基本特征，一方面，細胞死凋亡數量減少，另外一方面細胞增殖和細胞去分化增加。腫瘤被理解為是細胞周期疾病，是因為眾多的與腫瘤細胞發育有關的各種因素最終作用在控制細胞周期[4]。細胞增殖是被細胞周期調節控制的，G1/S期和G2/M期是細胞周期中調節細胞周期運行的關鍵調控點。文獻報道，使腫瘤細胞在G2/M期聚集的中藥有款冬花、側柏葉、高良姜、銀杏、姜黃等提取物，他們可以引發抗腫瘤作用[5～7]。

本試驗表明，川芎嗪作用MCF-7細胞，改變細胞周期的分布，一方面。MCF-7細胞數在G0/G1期增加，呈劑量依賴性，另外一方面。MCF-7細胞在G2/M和S期細胞數目減少；這個結果說明川芎嗪可使細胞聚集在G1期，細胞不能進入S期進行DNA的復制和不能進入M期進行有絲分裂，這樣就能導致腫瘤細胞增殖抑制和腫瘤細胞凋亡，所以我們認為川芎嗪抑制MCF-7細胞增值與其影響細胞周期分布有關。

[1]王建峰.丹參川穹嗪注射液治療膠原誘導性關節炎大鼠的實驗研究[J].黑龍江醫藥科學,2013,36(6)：23-24

[2]謝佐福,沈世仁.川芎嗪和羥基脲對阿霉素K562 細胞株DNA合成的影響[J].中華醫學雜志,1997,73(9)：559-560

[3]劉錦蓉,葉松柏.川芎嗪抗腫瘤轉移作用及其機制[J].中國藥理學與毒理學雜志,1993,7(2)：149-152

[4]張濤,田黎明,王昭,等.白花敗醬草對U14荷瘤鼠腫瘤細胞周期和PCNA表達的影響[J].黑龍江醫藥科學，2011,34(3):84-85

[5]WeiYQ,ZhaoX,KariyaY,etal.Inductionofapoptosisbyquercetin:involvementofheatshockprotein[J].CancerResearch,1994,54:4951-4957

[6]李嬪, 田國才, 林娜, 等. 廣棗總黃酮對小鼠胸腺細胞凋亡及腺苷脫氧酶(ADA)活性的影響[J]. 中華微生物和免疫學雜志, 1998,18(6)：386-391

[7]薛妍, 夏天, 趙建斌, 等. 姜黃素對人肝癌細胞SMMC-7721的抑制作用[J]. 第四軍醫大學學報, 2000,25(5):84-86

1.黑龍江省大學生創新創業訓練計劃項目，編號：201510222026；2. 佳木斯大學科基礎研究類(自然類)面上項目，編號：JMSUJCMS2016-023；3.黑龍江省普通高等學校青年學術骨干支持計劃項目，編號：1252G059。

宋慶嬌(1996～)女，黑龍江肇東人，在校本科生。

張濤(1971～)女，黑龍江嘉蔭人，博士，教授，碩士研究生導師。E-mail：ztlzy888@163.com。

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1008-0104(2017)02-0027-02

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