不同程度扁平苔蘚患者治療前后唾液中IL-17與念珠菌水平變化①

朱建華，苗藝繽，劉繼光

(佳木斯大學附屬口腔醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

不同程度扁平苔蘚患者治療前后唾液中IL-17與念珠菌水平變化①

朱建華，苗藝繽，劉繼光

(佳木斯大學附屬口腔醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：探討扁平苔蘚患者口腔念珠菌定殖數量與唾液中白細胞介素17(IL-17)表達水平及其之間的關系。方法：選取40例口腔扁平苔蘚伴有唾液念珠菌鏡檢陽性的患者，局部應用制霉菌素抗真菌治療，并采集患者治療前后的唾液，應用含漱液濃縮培養法檢測念珠菌定殖數量，通過酶聯免疫吸附試驗檢測唾液IL-17表達水平，通過單位體積唾液念珠菌數量分為念珠菌感染組(實驗組)和非感染組(對照組)，并分別記錄兩組治療前后念珠菌記數的變化和IL-17水平的變化，進行統計分析。結果：實驗組經過治療，il-17表達水平(11.47±3.71)ng/L明顯低于治療前(8.30±2.85)，差異有統計學意義(P<0.05),口腔念珠菌數量與唾液IL-17表達水平呈正相關(r=0.427，P=0.006);對照組在治療前后il-17表達水平無明顯變化。結論：念珠菌感染可以引起扁平苔蘚患者唾液中il-17含量的升高，通過抗念珠菌治療可以減少扁平苔蘚患者唾液IL-17表達水平。

口腔扁平苔蘚；白色念珠菌；白細胞介素17；唾液

扁平苔蘚是常見的皮膚黏膜病變。最先被Wilson在1869年發現并且影響0.5%～1%世界人口[1]。病變可以影響黏膜和皮膚，有時兩者共存，OLP可能的病因包括(1)遺傳因素(2)牙科材料(3)用藥(4)感染因素-微生物或病毒(5)自身免疫(6)免疫缺陷(7)食物過敏(8)精神壓力(9)不良習慣(10)創傷(11)糖尿病和高血壓[2]。大量研究傾向于免疫因素，特別是朗格漢斯細胞和角質形成細胞的激活[3]。呈遞抗原給CD4+T細胞，這些細胞分泌IFN-β，它是一個Th1細胞因子，可以激活CD8+毒性T細胞導致基底細胞凋亡，但是除了傳統的Th1,Th2細胞，Th17細胞組成了第三個具有特定功能的效應T細胞的子集，Th17細胞在宿主對抗特定病原體比如白色念珠菌和特定細胞外細菌都有影響，然而廣泛的IL-17的受體分布導致Th17細胞激活可以引起嚴重的組織反應，有可能是潛在的自身免疫炎癥的病因。口腔是一個復雜的生態系統包括多種黏膜上皮細胞，并不斷的接受唾液的沖洗。口腔念珠菌是人類最易感染的微生物，特別是生命中的早期與晚期階段，在普通人群中，無癥狀念珠菌攜帶率在20%～75%，其中新生兒攜帶率為45%，健康兒童為45%～65%，健康成人為30%～45%，帶有可摘義齒人群為50%～65%，接受化療的急性白血病患者為90%，HIV陽性患者為95%。白色念珠菌是口腔正常菌群，在健康人中一般不引起任何癥狀，但是若菌群的過度生長會引起局部組織不適，味覺的改變以及吞咽困難，甚至免疫功能異常的患者感染可以擴散到血液或胃腸道。系統念珠菌病死亡率達71%～79%[4,5]。OLP病理表現是局部上皮細胞破壞，念珠菌對上皮的附著是感染的第一步，因其不受唾液沖刷的影響，念珠菌感染也可能是繼發于OLP病變之后，并且加重OLP的體征(局部不適和燒灼感)。大量研究表明口腔扁平苔蘚患者念珠菌感染幾率高于健康人[6]。有實驗說明Th17細胞途徑在黏膜和上皮特別是口腔黏膜和口外皮膚對真菌的免疫中扮演了重要的角色[7]。但是念珠菌感染和扁平苔蘚的因果關系暫時不明確。本研究的目的是通過酶聯免疫吸附試驗檢扁平苔蘚伴白念感染的患者在抗真菌治療前后，唾液中念珠菌水平與唾液中的炎癥因子IL-17水平表達差異和相互作用關系，探討抗真菌治療對于扁平苔蘚臨床治療的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

40例OLP患者選自佳木斯大學附屬第二醫院牙周病門診。納入標準包括：(1)在佳木斯大學口腔醫院就診的病理診斷為扁平苔蘚患者。(2)行微生物學檢查結果為白色念珠菌陽性并且菌落數CFU/mL>400。排除標準包括：(1)有過放射治療史。(2)牙體、牙周組織及口腔黏膜病變。(3)長期或近期(4周內)使用廣譜抗生素。(4)妊娠；吸煙。采集未刺激全唾液、含漱液，共采集樣本40例，男14例，女26 例，年齡60～89歲，平均69歲，其中唾液培養菌落陽性患者(CFU>400/mL)20例，真菌培養陰性患者(0

1.2 方法1.2.1 唾液樣本收集

采集樣本前30min所有實驗對象禁食,清水含漱后于早上 9：00-10：00期間,靜坐,頭前傾略低,向無菌離心管內緩緩流入非刺激性唾液5mL.采集的唾液于1h內送至實驗室，1.5mL分裝，-80℃冰箱保存。

1.2.2 菌落計數

顯色瓊脂培養基中上面生長翠綠色的菌落。

1.2.3 用ELISA試劑盒測定唾液IL-17濃度

患者靜坐5min后用10mL0.01mmol滅菌PBS緩沖液含漱，將含漱液放入無菌離心管內。標本于1h內送至實驗室，將采集的漱口液于4000r/min4℃離心10min，除去上清液，重新混勻,分別取100μL混懸液接種于3個顯色瓊脂培養基。37℃孵育48h后觀察菌落并記錄下3個培養基中菌落形態及總菌落數(CFU)。結果判定參照試劑手冊。以健康對照者為陰性對照；經滅菌處理的空培養基為空白對照。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 實驗組20例患者中男4例，女16例,平均年齡(69.9±7.71)歲。對照組男3例，女17例，平均年齡(66.9±4.41)歲，實驗組與對照組年齡和性別差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2 兩組患者唾液念珠菌數量比較：實驗組20例有16例口腔念珠菌數量大于400CFU/mL，對照組20例均小于400CFU/mL,經卡方檢驗分析，兩組比較具有統計學差異。兩組念珠菌數量比較具有統計學差異。(P<0.05)見表1。

表1 實驗組和對照組口腔念珠菌數量比較(CFU/mL)

注：P<0.05

2.3 兩組患者唾液中IL-17水平變化的比較：ELISA測定樣本中IL-17濃度，采用獨立樣本t檢驗分析實驗組治療前后的變化以及對照組治療前后的變化，差異具有統計學意義(P=0.04)，結果服從正態分布，用均值加減標準差的形式表示結果；對照組患者治療前后IL-17水平無明顯差異(P=0.227)。見表2。

分組治療前il-17濃度治療后il-17濃度實驗組11.47±3.718.30±2.85對照組4.40±1.765.11±1.91

注：P=0.227

2.4 口腔念珠菌數量和唾液IL-17水平的相關性分析：對實驗組和對照組分別作pearson相關性分析。結果，實驗組口腔念珠菌與唾液il-17水平成正相關(r=0.427,P=0.006),對照組二者無相關性(P=0.170)。見表3～4。

表3 實驗組口腔念珠菌數量和唾液IL-17濃度相關性

注：P=0.006

表4 對照組口腔念珠菌數量和唾液IL-17濃度相關性

注：P=0.170

3 討論

念珠菌感染被分為原發性和繼發性，繼發性感染時疊加在其他疾病病變部位基礎之上，比如OLP，可以增加念珠菌病的易感性。有關口腔念珠菌病與口腔扁平苔蘚之間的關系已有學者研究有的學者觀察到糜爛型OLP與非糜爛型OLP的念珠菌數量無顯著差別，指出念珠菌并非糜爛型OLP的病因。亦有學者指出糜爛型OLP較非糜爛型OLP有更高的念珠菌檢出率[6]。因而念珠菌感染是OLP的病因還是因為OLP導致的念珠菌感染還需要進一步研究。

白細胞介素17是促炎細胞因子，可以導致多種炎性疾病，大量大鼠實驗結果確定IL-17和TH17細胞在炎性疾病，自身免疫疾病以及宿主抵抗中起到相關病原體的作用。相關臨床試驗結果表明:通過抑制IL-17細胞因子的釋放對治療銀屑病，關節炎等自身免疫病有臨床效果[8]。IL-17的過度表達可以在多種自身免疫病和炎性疾病中觀察到，該細胞因子起到的病理作用早已經被證實[9]。而扁平苔蘚是T細胞介導的免疫疾病，所以IL-17細胞因子在局部炎癥反應中起了至關重要的作用，人類念珠菌反應性CD4+T細胞表達Th17標記物比如IL-17。亦有研究表明炎癥反應會增加白色念珠菌局部感染幾率，同時念珠菌定殖會阻礙病變的恢復，從而形成惡性循環：局部炎癥反應的存在改變了局部菌群的結構，形成了有利于大量念珠菌定殖的環境，加重疾病反應。以往研究表明:IL-17以及其他Th-17細胞因子在宿主黏膜表面通過引導固有免疫比如(中性粒細胞激活因子，抗菌肽)來防御病原體。大鼠實驗觀察胃部及口腔白色念珠菌的定殖導致IL-17和IL-23釋放的增加[10]，因此念珠菌感染提高了機體細胞因子的釋放IL-17進一步使炎癥反應加重。與本實驗結果相符合。

本實驗結果表示口腔扁平苔蘚伴有念珠菌感染患者口中唾液白色念珠菌水平與白細胞介素17濃度呈正相關，說明通過減少扁平苔蘚病變部位白色念珠菌數量可以降低唾液中炎癥因子的濃度，說明白色念珠菌作為扁平苔蘚可能的致病因素之一，可以引起患者局部病變部位IL-17細胞因子濃度增加，加重局部炎癥反應，從而為通過治療白色念珠菌病來治療扁平苔蘚提供臨床依據。

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佳木斯大學研究生科技創新項目,編號：YM2016-073。

朱建華 (1959～)女，黑龍江佳木斯人，本科，教授，碩士研究生導師。

劉繼光(1961～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導師。E-mail:miao.miao@me.com。

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1008-0104(2017)02-0040-02

2016-10-09)