AEG-1與MMP-9在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義①

宋 瑒,王彩霞

(佳木斯大學附屬第一醫院病理科，黑龍江 佳木斯 154003)

AEG-1與MMP-9在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義①

宋 瑒,王彩霞

(佳木斯大學附屬第一醫院病理科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探討星形膠質細胞升高基因1(Astrocyteelecatedgene-1,AEG-1)及基質金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinases-9,MMP-9)在甲狀腺乳頭狀癌(papillarythyroidcarcinoma,PTC)中的表達及意義。方法：采用免疫組化EnVision法檢測63例PTC及30例癌旁正常組織中AEG-1和MMP-9的表達，并復習相關文獻。結果：AEG-1和MMP-9在PTC組中的陽性率分別為68.3%(43/63)、60.3%(38/63)，在癌旁正常對照組陽性率分別為23.6%(8/30)和16.7%(5/30)，AEG-1和MMP-9在PTC中陽性表達率均高于癌旁正常組織(χ2=14.192，P<0.05；χ2=15.577，P<0.05)。PTC中AEG-1和MMP-9表達具有一致性。AEG-1和MMP-9的表達與腫瘤大小、淋巴結轉移密切相關，與患者性別、年齡無相關性，且AEG-1和MMP-9的表達呈正相關(r=0.142,P<0.05)。結論：AEG-1和MMP-9的表達與PTC發生、發展密切相關，聯合檢測二者可能對PTC的診斷及轉移潛能提供新的理論依據。

AEG-1；MMP-9；甲狀腺乳頭狀癌；免疫組織化學

甲狀腺癌是甲狀腺腫瘤最常見的類型，占甲狀腺惡性腫瘤的70%～80%。女性比男性常見。可發生于任何年齡，最初診斷時的平均年齡大約為40歲。兒童的甲狀腺惡性腫瘤90%為甲狀腺乳頭狀癌。甲狀腺乳頭狀癌在臨床表現為甲狀腺的腫塊，甲狀腺乳頭狀癌的發生受環境、遺傳及激素因素的影響或這些因素的相互作用。部分患者有頸部放射線接觸史。多數患者較早出現頸部淋巴結轉移，部分轉移還可至肺、骨、腦、肝等部位[1]。甲狀腺癌的診斷貴在早期發現，早期治療。經典型PTC與伴隨乳頭狀增生的甲狀腺結節在病理診斷中有時難以區別。本研究通過免疫組化EnVision兩步法檢測TPC及甲狀腺組織中AEG-1、MMP-9的表達情況。探討AEG-1、MMP-9與PTC發生、發展中的作用，為進一步揭示AEG-1、MMP-9在腫瘤中的作用提供實驗基礎。星形膠質細胞升高基因1(AEG-1)是近年多項研究表明AEG-1與腫瘤發生密切相關的基因，AEG-1是可促進腫瘤侵襲及轉移的致癌基因，以及與化療藥物抵抗等特征有關[2,3]。基質金屬蛋白酶9(MMP-9)具有很強的水解Ⅳ型膠原的能力，是腫瘤的侵襲和轉移過程中最直接、最重要的金屬蛋白酶之一。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究選取2010-06～2015-12佳木斯大學附屬第一醫院病理科保存的經手術切除的甲狀腺乳頭狀癌的石蠟標本63例作為研究對象(63例均已證實為原發性甲狀腺乳頭狀癌)隨機選取同期切除的癌旁正常甲狀腺組織30例。所有病例標本采用上述甲狀腺乳頭狀癌的蠟塊標本作3μm厚的連續切片，用免疫組化EnVision法染色后觀察結果，統計患者性別、年齡(其中女28例、男35例，年齡15～78歲)、癌腫大小(腫瘤大體d≤2.0cm者30 例，d>2.0cm者33例)、及是否存在淋巴結轉移；淋巴結轉移39例(其中10例為微小乳頭狀癌淋巴結轉移)，無淋巴結轉移者24例。

1.2 試劑

兔抗人AEG-1多克隆抗體購自CellSignalingTechnology公司；鼠抗人MMP-9單克隆抗體工作液、即用型快捷免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術公司。

1.3 免疫組化檢測

采用免疫組化EnVision法，分別對TPC和正常甲狀腺組織用AEG-1和MMP-9抗體染色，統計表達情況。用胃癌組織做陽性對照，用PBS緩沖液替代一抗做陰性對照。

1.4 判讀標準

鏡下觀察組織切片的染色強度，AEG-1和MMP-9陽性表達主要定位于細胞質，以出現胞質黃色、棕黃色或棕褐色為陽性表達。根據Beesley和Mclaren[4]分級方法，每張切片觀察5個高倍視野(×400)，根據細胞染色強度和染色細胞所占的比例兩者乘積作為判讀標準。按陽性的細所占比例計數，陽性細胞占<5%為0分，陽性細胞占5%～25%為1分，陽性細胞占6%～50%為2分，陽性細胞占>50%記3分, 陽性細胞占>75%記4分；染色強度標判定計分，無色為0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分，兩種評分相乘，將結果分為：0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性()，9～12分為強陽性()。

1.5 統計學方法

采用SPSS17.0 統計學系統軟件處理，AEG-1和MMP-9臨床病理因素采用χ2檢驗統計分析。AEG-1 與MMP-9相關性分析采用Spearman相關分析。

2 結果

2.1AEG-1在PTC及癌旁正常甲狀腺組織中的表達

AEG-1在大部分PTC中表達，陽性表達為68.3%，在癌旁正常組織陽性率僅為26.7%，AEG-1在PTC的陽性表達明顯高于正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)。而AEG-1在PTC中的表達與腫瘤直徑大小(P<0.05)、淋巴結轉移(P<0.01)有關,但與患者性別、年齡無關(P>0.05)。

2.2MMP-9在PTC及癌旁正常甲狀腺組織中的表達

MMP-9在PTC中陽性表達率為60.3%，在癌旁正常甲狀腺組織陽性表達率僅為16.7%，MMP-9在PTC中陽性率明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。MMP-9在PTC中的表達與腫瘤直徑大小(P<0.01)、淋巴結轉移(P<0.01)有關，但與患者性別、年齡無關(P>0.05)。

2.3AEG-1與MMP-9表達與PTC參數相關關系

AEG-1高表達組中，MMP-9的陽性率為72.1%。該值顯著高于MMP-9在陰性組中的表達(AEG-1陰性組中，MMP-9的陽性表達率為35.0%)，兩者有統計學差異(χ2=7.847，P<0.05)。Spearman相關分析檢測得出(r=0.142,P<0.05)。AEG-1與MMP-9在PTC中的表達呈正相關。見表1。

表1 AEG-1和MMP-9在PTC中表達的相互關系

3 討論

腫瘤大小不一，從<1cm(微小癌)到幾個厘米，并常見多中心生長。表現為不同的大體形態，大多數腫物切面為灰白色、實性、邊界不清。鏡下，腫瘤形成真正的乳頭(有纖維血管軸心)，乳頭通常復雜，具有分支，排列方向無序。毛玻璃樣細胞核，核較大并有重疊。可見核溝及核內假包涵體。砂粒體的出現高度提示微乳頭狀癌的診斷。免疫組化染色：細胞角蛋白(CK)陽性，CK7+/CK20-，角蛋白19和高分子角蛋白染色陽性對診斷有一定的幫助，甲狀腺球蛋白(Tg)和甲狀腺轉化因子-1(TTF-1)陽性，其他抗體包括galectin-3和HBME-1，雖然他們在乳頭狀癌中高比例表達，但并無特異性。多數患者較早發現淋巴結轉移，還可轉移至肺、骨、腦、肝等部位。PTC原發灶常較小，但發現是已轉移至淋巴結，本實驗分組中有25%為微小乳頭狀癌有淋巴結轉移。而有無淋巴結轉移成為預后的重要影響因素，因此了解PTC的轉移和侵襲潛能有助于輔助診斷和評價甲狀腺癌臨床生物學行為。甲狀腺癌的診斷貴在早期發現，早期治療。

AEG-1是今年來新發現的對腫瘤發生發展來說是一個關鍵性的調控因子。今年研究表明AEG-1高表達與癌腫細胞，正常細胞則為陰性或低表達。AEG-1能夠抑制腫瘤細胞侵襲和轉移能力。Hu等[5]研究表明，食管鱗癌中AEG-1陽性表達明顯強于對正常組織。Yu等[6]研究發現，乳腺癌發生肺轉移AEG-1陽性表達率顯著增高，而抑制AEG-1的表達則可降低乳腺癌肺轉移率。另有研究表明，AEG-1強陽性能促使宮頸癌和神經膠質細胞轉移[7]。用RNAi技術抑制AEG-1在神經膠質瘤、前列腺癌中的表達率，能抑制神經膠質瘤、前列腺癌轉移[8]。但目前AEG-1在PTC中的表達研究較少。本研究表明，AEG-1在PTC中高表達而在良性甲狀腺病變中僅少數呈散在弱陽性表達，其余為陰性。因此，AEG-1可為診斷PTC診斷工作提供依據，AEG-1低表達有助于良性腫瘤的判斷和初步排除腫瘤存在惡性侵襲能力。

MMP-9基因位于染色體20q11.1～13.1，26～27kbp，具有13個外顯子和9個內含子，屬于基質金屬蛋白酶(MMP)家族。主要功能是降解和重塑細胞外基質(extracellularmatris)的動態平衡。MMP-9包含一個V型的膠原蛋白結構域,這個結構域有高度的糖基化作用,它影響底物的特異性以及有抗衰變的作用[9]。MMP-9有許多作用底物，如Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型膠原、蛋白聚糖的核心蛋白、明膠、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、彈性蛋白等，細胞因子及其受體也是MMP-9作用的底物。MMP能分解呼吸道和肺內的結構復合物如ECM和基底膜,因此能參與呼吸道和肺的重建[10]，它能降解α1抗胰蛋白酶，保護中性粒細胞彈性蛋白酶活性,能加強膠原質膠體中膠原細胞和MMP-13的溶膠原活動，它也抑制其他中性粒細胞的趨化因子。此外，MMP-9結合CD44可釋放儲存的TGF-β1，另外，MMP-9可通過釋放血管內皮生長因子(VEGF)以參與血管生成。MMP-9分解Ⅳ型膠原分解基底膜，促進腫瘤向外和其它器官組織浸潤及淋巴結轉移。本例實驗，MMP-9在PTC高表達與癌旁甲狀腺組織，因此MMP-9與PTC的發生發展密切相關。PTC常發生于孤立的小結節，病灶常常較小，發現時往往已有淋巴結轉移，本實驗中25%微小乳頭狀癌有淋巴結轉移。多數據報到認為淋巴結轉移是影響預后的重要因素，因此了解PTC的轉移和侵襲潛能有助于輔助診斷和評價甲狀腺癌臨床生物學行為。本研究發現，MMP-9高表達與患者年齡、性別無關，而腫瘤大小及淋巴結轉移有關。提示MMP-9陽性率越高，形成Ⅳ型膠原酶能力越強，破壞基底膜能力越大，越容易發生腫瘤浸潤和淋巴結轉移。進一步表明檢測MMP-9對腫瘤良惡性鑒別及評估PTC的生物學行為，提示MMP-9在甲狀腺乳頭狀癌的發生及腫瘤轉移中發揮重要作用。

綜上所述，本實驗結果提示，AEG-1與MMP-9協調參與了PTC的發生發展，聯合檢測，可能對PTC的病理診斷及轉移潛能提供新的理論依據。但是AEG-1和MMP-9之間的相互調控機制，及抑癌基因的關系仍需更進一步增加實驗臨床研究。

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宋瑒(1989～)女，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。

王彩霞(1964～)女, 黑龍江佳木斯人,學士，主任醫師，教授,碩士研究生導師。E-mail:wcx19641027@163.com。

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1008-0104(2017)02-0128-02

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