甲殼動物免疫系統回路分析

王孟孟+馬寨璞+管越強+張凱利

摘要：利用構建的甲殼動物免疫系統圖，運用系統生物學方法對各免疫因子的相關關系進行探討。將免疫系統圖中重要的免疫因子抽象為節點，節點之間的邊代表著因子之間的相關關系，則將整個免疫系統圖抽象為一個充滿節點的系統網絡圖。通過所構建的系統網絡圖，尋找了兩個或多個因子之間的作用機制，以及各免疫路徑之間的關系；利用建立的物理數學原理來揭示因子之間的免疫反應作用機制，解答免疫中的反應現象。揭示免疫刺激劑的免疫作用機理，促進整個免疫系統的免疫水平評價。

關鍵詞：甲殼動物；免疫回路；圖論；節點

隨著水產養殖業的大規模發展，養殖過程中各種病毒和細菌對水產品產量的影響越來越嚴重；因此，對于怎樣提高甲殼動物免疫力來抵抗病害是研究的重點。對各種免疫刺激劑如免疫多糖、中草藥等的研究越來越多，例如Deng等[1]研究了從冬蟲夏草菌絲體中提取的多糖類物質對于凡納濱對蝦生長、免疫和抗氧化能力的影響。但僅憑幾個免疫相關酶的指標來直接判斷甲殼動物的免疫能力，顯然不全面。甲殼動物免疫包括多條路徑，如包囊作用，吞噬作用等，并且各路徑之間相互影響、相互作用，一條路徑的變化不能衡量整個免疫系統的能力。然而對于免疫刺激劑的研究，大部分研究都是通過測免疫指標的變化來評價的，具體的作用機理尚不清楚；例如陳昌福等[2]研究了免疫多糖對南美白對蝦免疫相關酶的激活作用。本文利用系統生物學的思想，將免疫系統網絡圖抽象為多節點圖，利用圖論的方法進行研究，并運用數學物理原理來揭示免疫因子之間或路徑之間的作用機制，同時對于免疫刺激劑的免疫應答做出重要說明。

1甲殼動物免疫系統網絡關系模型總圖

甲殼動物免疫系統是一個內部相互聯系、相互影響的復雜網絡，其中包括多條免疫路徑：如吞噬作用、包囊作用、修復作用等。由參考文獻[3]得到甲殼動物免疫網絡系統圖（圖1）。圖中標示：代表反應物質，代表作用過程；代表殺死病原體；代表著反應流程或物質生成，代表促進作用，代表阻抑作用。

2圖論分析

對于建立的全面的免疫系統圖，運用圖論的知識進行整理分析。1969年，Kauffman提出了著名的布爾網絡（Boolean Network，BN）模型，用以研究基因調控網絡和細胞分化過程[4-5]。借助于此類思想，通過構建網絡模型來研究免疫調控網絡。將甲殼動物免疫系統圖抽象為一個免疫網絡有向圖，其中免疫網絡中的物質及反應過程抽象為節點，免疫網絡中節點之間的關系對應圖中的邊。圖中的節點和邊可以帶有本身的屬性，邊分為有向或無向的，分別代表著生化反應或免疫作用關系[6]。

2.1節點的出入度統計與分析

到目前為止，甲殼免疫系統中主要免疫途徑的物質及因子，可以確定下來的有51個，將其作為節點，與節點相關聯的邊數即為度數，輸入的邊數為入度，輸出的邊數為出度，入度與出度之和即為總度。各節點的名稱及出入度統計，如表1。

聚糖結合蛋白（βGBP），脂多糖（LPS），脂多糖結合蛋白（LGBP），肽聚糖結合蛋白（PGBP），細胞粘附因子（76ku），乙二胺四乙酸（EDTA），過氧化氫酶（CAT），過氧化物酶（SOD），酚氧化酶原激活酶原（proPPA），酚氧化酶原激活酶（PPA），酚氧化酶原（proPO），酚氧化酶（PO），透明細胞（HC），半顆粒細胞（SGC），顆粒細胞（GC），過氧亞硝酸鹽陰離子（ONOO-）。

對于各節點度的分布情況表（表1），對節點度的分布進行統計分析并繪制直方圖（圖2和圖3）。可知節點入度為1的有16個，為0的有12個；同時出度為1的有30個，只有少數的節點的出度大于3。

構建的甲殼動物節點圖中節點數N為51，因其不存在自連接的邊和兩節點間的相互邊，則可能產生的最大邊數為Emax=N（N-1），而在整個免疫網絡節點圖中實際的邊E為86條。則E/Emax的結果為3.37%，由此得出，所建的甲殼動物免疫節點圖是稀疏的。

對于出入度均為1的節點，在免疫路徑中不可替換，屬于具有唯一性的節點，此類節點一旦出問題，與此節點有關的網絡通路將會失去作用。某一路徑受阻，整個免疫系統就會受到一定程度的阻力。例如，當溶菌酶因各種因素失活的時候，整個溶菌酶殺菌系統就會切斷，從而加重其他路徑的壓力。多個出、入度的節點，說明是免疫通路的交匯點，此類節點出現問題，就會影響多條通路，甚至引起免疫系統的癱瘓。脫顆粒作用、吞噬作用、包囊作用等免疫作用的出入度較高，屬于比較關鍵的節點；proPO、PO等免疫因子的出入度也高，屬于免疫系統調節的關鍵因子，在整個甲殼動物免疫系統中具有重要的作用。根據實驗中的結論，PO確實在免疫過程中充當關鍵的免疫樞紐的位置。

所建甲殼動物免疫網絡的度分布表現為冪律形式，冪律是指節點具有的連接線與該節點的乘積是一個定值，也即是說，度數小的節點多，度數大的節點少。在所建立的甲殼動物免疫網絡節點度的統計中，頻率直方圖具有“長尾”現象，即節點數存在多的度數小，度數大的節點數少。高連接的節點、度數較高稱為中樞節點，在整個免疫系統的演變中，對免疫網絡各項性質起著關鍵性的作用，缺少了這類節點，整個免疫系統能力急劇下降，甚至陷入癱瘓。而連接數較少的節點，只能左右個別路徑，在整個免疫系統中影響范圍相對較窄。

2.2作圖

通過對51個免疫節點的相關關系生成了對應的鄰接矩陣，作圖得到甲殼動物免疫系統網絡節點圖（圖4）。

3圖中各種調節機制的分析

通過構建免疫系統節點間關系，揭示了各免疫因子之間的相互作用。在免疫系統節點圖中，本文主要研究三個節點間的相互作用，利用物理原型解釋免疫反應的相關過程。從圖4可知免疫網絡圖的相關關系是稀疏的。從整個免疫系統節點圖中，分離出多種子圖。將其分為兩大類：一種是四個及四個以上連續連接且無支路的節點組成的串型結構，如圖5；一種是三個或三個以上節點組成一個或多個回路結構的回路結構圖，如圖6。此處主要討論三個或四個節點的回路結構圖。

3.1串型結構圖的特點及作用

在免疫串型結構傳遞信號的過程中，信號逐漸減弱，像水波一樣，在傳播過程中越來越弱。只有持續的進行免疫刺激，才能發揮應有的免疫反應作用。免疫反應特點：免疫消除不良刺激，避免不必要的刺激對機體帶來的損傷，保證整個網絡系統的穩定性。

3.2回路結構圖的特點及作用

在圖論的知識中，三節點之間的相互作用總共反應類型可分為多種，比較常見的三節點生物關系圖有前饋環和反饋環兩種[4，7]，從免疫系統節點圖中分離出以下9種免疫系統子圖，如圖6。其中1-7屬于前饋環，8屬于反饋環，9屬于四節點的相互作用。

3.2.1前饋環

前饋環是由三個因子組成。第一個因子調節第二個因子，然后兩個因子一起調節第三個因子，所以前饋環擁有2條平行的調節路徑，即一條從第一因子到第三因子的直接路徑以及一條第二因子到第三因子的間接路徑。直接路徑由一條邊組成，而間接路徑則由2條邊級聯而成，其中邊代表的促進和阻抑作用相當于物理中的正信號和負信號。前饋環具有23種不同的形式。文中討論了協調型前饋環，如圖7；非協調型前饋環，如圖8兩種形式。

①協調型前饋環

在甲殼動物免疫中，PO既催化單酚形成雙酚，又可以催化雙酚形成醌。在此類免疫過程中，第一步反應生成雙酚，隨著雙酚的積累，達到一定的閾值，PO和雙酚作用生成醌。如圖7，O的生成，需要M和N兩個信號的共同作用，只有當M的作用時間足夠長，產生的N積累，達到反應需要的閾值，才可生成O，生成O的過程必須要經過一個延遲。整個過程類似于信號敏感延遲元件，此類元件能防止短暫的輸入信號的波動。甲殼動物所處的環境經常是高度波動的，短暫的刺激引發的反應，不僅消耗機體的能量，而且免疫反應產生的一些物質損害機體。這類元件的過濾作用有利于機體的穩定性。

②非協調型前饋環

在非協調型前饋環中，如圖8，物質A的加入，促進物質B和C的產生，同時B對C具有抑制作用。表現在免疫系統中，加入免疫多糖，甲殼動物免疫體內過氧根離子的含量和SOD的含量均上升，最終過氧根離子的含量達到不對機體損害的閾值，趨于穩定。作用原理：SOD將過氧根離子轉化為過氧化氫等物質，減少過氧根離子的濃度從而降低其對于機體的損害。此類回路結構具有信號敏感加速器的作用，如圖9。

此類免疫作用結構能加速系統的響應時間，響應時間是動力學曲線達到穩態水平一半時所需的時間；如圖9所示，非協調型的響應時間遠低于簡單調節的響應時間；此結構可以快速地達到最高速率。圖8中，產生C的同時產生延遲中的阻抑物B來降低C的量，從而達到預期的穩態水平。在甲殼動物免疫中，此類結構可以使得反應迅速進行，提高免疫效率，同時產生的SOD又可以在極短的時間內，使得過氧根離子的含量降低，防止其長時間高濃度存在對甲殼動物機體造成傷害。信號敏感反映了甲殼動物免疫反應的及時性，即在極短的時間內對有害物質進行清除的能力。

3.2.2反饋環

反饋型網絡表現出了非線性系統的動態狀況，網絡系統具有多種穩定狀態，當網絡從某種初始狀態開始運動，生物網絡系統收斂于某一種穩定的平衡狀態[4]。甲殼動物免疫系統也一樣，具有免疫平衡狀態，并不斷處于動態平衡的穩定狀態。酚氧化酶原激活系統中，正是絲氨酸抑制劑的反饋調節機制，使得整個免疫系統處于穩定狀態。

4總結

甲殼動物免疫系統錯綜復雜，各免疫分支途徑之間相互協調合作，保證整個免疫系統的高效而穩定。（1）將圖中免疫因子或免疫反應抽象為節點，節點間的連線表征了物質之間的關系，構建整個免疫系統網絡節點圖。（2）分析了網絡中節點間的相關關系；并利用相關物

理數學模型，揭示了部分免疫因子對整個免疫系統的影響。（3）從系統的角度看待甲殼動物免疫，對整個免疫系統的高效穩定的免疫機制進行了物理性原理描述，以期探索更加高效的免疫反應機制。但是，對于整個系統網絡數據的研究尚缺乏，對于多節點及其之間的機制，尚待研究；對于整個系統缺乏一個動態有效的免疫反應狀態，需要進一步探討；對于免疫增強劑，如免疫多糖和中草藥具體作用強弱關系，需進一步確定。

參考文獻：

[1]

DENG B，WANG ZP，TAO WJ，et al.Effects of polysaccharides from mycelia of Cordyceps sinensis on growth performance，immunity and antioxidant indicators of the white shrimp Litopenaeus vannamei[J].Aquaculture Nutrition.2014，21：173-179

[2] 陳昌福，陳萱，陳超然，等.水產甲殼動物的免疫防御機能及其免疫預防研究進展[J].華中農業大學學報.2003，22（2）：197-203

[3] 王孟孟，馬寨璞，郭林豪，等.甲殼動物免疫系統網絡關系模型[J].河北大學學報.2017，37（3）：288-294

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[5] 鄒權，陳啟安，曾湘祥，等.系統生物學的網絡分析方法[M].西安：西安電子科技大學出版社，2015

[6] 左孝凌，李為鑑，劉永才.離散數學[M]. 上海：上海科學技術文獻出版社，2006

[7] 雷錦志.系統生物學+建模+分析+模擬[M]. 上海：上海科學技術出版社，2010