北極參多肽酶解工藝優(yōu)化

王迪+宋悅凡+劉舒+武龍+叢海花+谷越+汪秋寬

摘要：北極參（Cucumaria frondosa） 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，體壁質(zhì)厚，有極高的開(kāi)發(fā)成多肽產(chǎn)品的潛能。本文以北極參為原料，研究最優(yōu)酶解工藝。基本成分測(cè)定結(jié)果顯示，北極參蛋白質(zhì)含量95.03%，脂肪1.76%，灰分247%。以酶解液中多肽得率為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)枯草桿菌中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶組成復(fù)合酶進(jìn)行酶解，通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)，優(yōu)化加酶量、酶解時(shí)間、溫度與pH，確定最優(yōu)酶解工藝；正交試驗(yàn)結(jié)果顯示北極參的最優(yōu)酶解工藝為：酶解溫度為 50 ℃、pH為 8.0、料液比 1∶5、酶解時(shí)間為 5 h、加酶量為 2.09%，多肽得率為 15.38%；酶解產(chǎn)物的氨基酸組成結(jié)果表明氨基酸總量占干重約 85%；通過(guò)Sephadex G-50對(duì)北極參酶解液的多肽分子量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示分子量范圍在 1 080～12 052 Da。

關(guān)鍵詞：北極參（Cucumaria frondosa） ；正交試驗(yàn)；酶解工藝

海參是海參綱的一種棘皮動(dòng)物，從古至今一直被譽(yù)為名貴滋補(bǔ)食品、藥材[1]，全世界大約有1 700多種不同海參，我國(guó)本土捕撈的可食用海參有20多種[2]。海參是典型的蛋白含量高、脂肪含量低、低糖、高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的海產(chǎn)品[3]。對(duì)海參生物活性物質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)海參富含多種生物活性物質(zhì)[4]。其中的海參多肽具有良好的生物活性功能，食用起來(lái)安全，人體消化吸收容易，還能夠提高機(jī)體免疫力等[5]。近些年來(lái)，對(duì)于海參多肽研究主要還是集中于工藝提取優(yōu)化和機(jī)理活性，研究表明，海參小分子肽具有很多功能作用。殷廷[6]等對(duì)海參水煮液進(jìn)行酶解，并用大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附試驗(yàn)，得到的三個(gè)多肽組分均存在良好的抗氧化活性。

北極參（Cucumaria frondosa）別名大西洋海參，體壁厚實(shí)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是開(kāi)發(fā)多肽類(lèi)產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)原料。Suwanmala[7]等發(fā)現(xiàn)北極參可提高小鼠體內(nèi)SOD水平，在小鼠體內(nèi)具有抗氧化作用。由于海參不同種質(zhì)之間和捕撈海域的不同，使得海參在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值上差異較大，這困擾了海參多肽產(chǎn)品的生產(chǎn)者和消費(fèi)者，為充分利用北極參這一營(yíng)養(yǎng)優(yōu)質(zhì)、價(jià)格低廉的資源，本研究以多肽得率為指標(biāo)，優(yōu)化多肽酶解制備工藝，選用復(fù)合酶對(duì)北極參多肽酶解最優(yōu)制備工藝參數(shù)進(jìn)行初步研究，為增加北極參的高效利用和深度開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

北極參（水發(fā)）由大連水產(chǎn)企業(yè)提供；枯草桿菌中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶購(gòu)自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；藍(lán)葡聚糖、桿菌肽、胰島素、細(xì)胞色素c、胰凝乳蛋白購(gòu)于索萊寶公司；乙腈、氨基酸分析試劑盒為色譜純，Sephadex G-50凝膠購(gòu)置于GE Healthcare Bio-Sciences AB；其它化學(xué)試劑均為分析純。

721S分光光度計(jì)和TU-1810DAPC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，普析北京通用儀器有限責(zé)任公司；Elite-AAK 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），安捷倫1260高效液相色譜儀，安捷倫公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1海參基本成分測(cè)定蛋白質(zhì)GB/T 5009.5-2010[8]；粗脂肪GB/T 5009.6-2003[9]；粗灰分GB/T 5009.4-2010[10]。

1.2.2海參酶解工藝優(yōu)化以北極參為原料，將海參浸泡脫鹽[11]，勻漿，酶解，滅菌，雙縮脲法測(cè)定多肽含量。酶解分別以溫度、pH、料液比、時(shí)間、加酶量（與底物重量之比）為實(shí)驗(yàn)因素，進(jìn)行單因素和正交實(shí)驗(yàn)。

研究選擇風(fēng)味蛋白酶與枯草桿菌中性蛋白酶組成復(fù)合酶，酶比例為1∶3（酶活比）[12]。酶解單因素的條件選擇如下。

1.2.2.1酶解反應(yīng)溫度的選定在料液比1∶3（g/mL）、酶解時(shí)間4 h、加酶量1.74%，pH為70時(shí)，酶解溫度為45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃，測(cè)定上述酶解溫度對(duì)多肽得率的影響。

1.2.2.2酶解反應(yīng)pH的選定在料液比為1∶3（g/mL）、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間 4 h、加酶量為1.74%時(shí)，pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，測(cè)定上述pH對(duì)多肽得率的影響。

1.2.2.3酶解反應(yīng)料液比的選定在酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間4 h、加酶量1.74%，pH為70時(shí)，料液比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（g/mL），測(cè)定上述料液比對(duì)多肽得率的影響。

1.2.2.4酶解反應(yīng)時(shí)間的選定在料液比為1∶3（g/mL）、酶解溫度50 ℃，加酶量為1.74%，pH為7.0時(shí)，酶解時(shí)間為3、4、5、6、7 h，測(cè)定上述酶解時(shí)間對(duì)多肽得率的影響。

1.2.2.5酶解反應(yīng)加酶量的選定

在料液比1∶3（g/mL）、酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間4 h，pH為7.0時(shí)，加酶量為139%、174%、2.09%、2.44%、2.79%、314%，測(cè)定上述加酶量對(duì)多肽得率的影響。

1.2.3正交試驗(yàn)依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1所示。

1.2.4北極參多肽含量測(cè)定使用三氟乙酸結(jié)合雙縮脲法[13]，測(cè)定酶解液中多肽得率。5 mL北極參酶解上清液+5 mL的10%三氯乙酸，4 000轉(zhuǎn)離心10 min，上清液多肽得率雙縮脲法測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)品用牛血清蛋白，做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[14]。通過(guò)北極參酶解液中多肽濃度計(jì)算酶解液中多肽得率，多肽得率（百分比）等于北極參酶解液的體積與北極參酶解液中多肽濃度相乘后除以北極參中的蛋白質(zhì)含量。

1.2.5北極參酶解液氨基酸組成分析衍生使用安捷倫氨基酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行，安捷倫1260高效液相色譜儀分析檢測(cè)。柱溫，27 ℃；檢測(cè)器二極管陣列；檢測(cè)波長(zhǎng)，360 nm/4 nm；流動(dòng)相流速：1.2 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相A，50%乙腈溶液；流動(dòng)相B，0.05 mol/L醋酸鈉-醋酸緩沖液（pH 6.4～6.8）加入1%N，N二甲基甲酰胺[14]。進(jìn)樣時(shí)的流動(dòng)相梯度A設(shè)定0 min，84%→4.3 min，69%→9.5 min，64%→17 min，45%→28 min，35%→34 min，0%→36 min，0%→38 min，84%。

1.2.6北極參酶解液分子量分布分析以桿菌肽（1 423 Da），胰島素（5 500 Da），細(xì)胞色素c（12 384 Da），胰凝乳蛋白（25 000 Da）為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)Sephadex G-50凝膠層析分析酶解液中分子量分布。

1.2.7數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件對(duì)每一試驗(yàn)三次平行數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析比較。

2結(jié)果與分析

2.1北極參基本成分

由表2可見(jiàn)北極參是一種高蛋白，低脂肪的健康食品；與王磊等[15]對(duì)東海海參體壁的營(yíng)養(yǎng)成分分析比較發(fā)現(xiàn)，粗蛋白含量為71.74%和王遠(yuǎn)紅[16]研究三種不同西沙群島海參科的海參蛋白質(zhì)含量均在70%左右，脂肪均在1%左右，本實(shí)驗(yàn)北極參蛋白含量高達(dá)95% 均高于這幾種海參，粗脂肪含量也較低，北極參中黏多糖含量未檢出（檢測(cè)方法參考鄭艾初等[17]），其原因可能與前期水發(fā)工藝有關(guān)。

2.2北極參酶解工藝優(yōu)化

2.2.1酶解溫度對(duì)酶解液中多肽得率的影響酶解溫度對(duì)北極參酶解液中多肽得率影響在圖1顯示。從圖1中可看出，在酶解溫度低于60 ℃時(shí)，北極參酶解液多肽含量隨著溫度升高而升高，60 ℃時(shí)多肽含量達(dá)最高值，當(dāng)酶解溫度高于60 ℃時(shí)，多肽含量急劇下降。分析原因，酶屬于一種特殊的蛋白質(zhì)，當(dāng)溫度沒(méi)有達(dá)到其最適溫度時(shí)，隨溫度上升得率不斷增加，在達(dá)到最適溫度后，再不斷地升高溫度，只會(huì)引起酶活的急劇下降，多肽得率也隨之下降[18]。在酶促反應(yīng)中溫度是重要因素。在試驗(yàn)過(guò)程中過(guò)度偏離最適溫度，將無(wú)法達(dá)到預(yù)期效果。

2.2.2pH值對(duì)酶解液中多肽得率的影響pH值對(duì)酶解液多肽得率的影響在圖2顯示，由于酶的特殊性，pH的改變會(huì)造成酶的失活[18]。由圖2可見(jiàn)，北極參酶解pH值越高，酶解液中多肽含量越高。風(fēng)味蛋白酶最適pH值在6.5左右，枯草桿菌中性蛋白酶最適pH 在7.0左右[19]，參考實(shí)驗(yàn)室其它海參研究結(jié)果[20]并與梁杰[21]等人對(duì)海參蛋白肽制備工藝的研究比較，發(fā)現(xiàn)偏堿性條件酶解效果更優(yōu)，所以，添加pH 8進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.3料液比對(duì)酶解液多肽得率影響料液比對(duì)多肽得率的影響在圖3顯示。如圖3中可見(jiàn)，北極參在料液比在1∶2～1∶4的范圍內(nèi)波動(dòng)時(shí)，酶解液多肽得率隨著水比例的上升而上升；料液比大于1∶4后，多肽得率變化趨勢(shì)趨于平緩。當(dāng)料液中水比重在逐漸增加時(shí)，底物與酶接觸面積便會(huì)減少，酶解反應(yīng)隨之變慢，反應(yīng)速率降低。因此料液比選在1∶4。

2.2.4酶解時(shí)間對(duì)酶解液中多肽得率的影響酶解時(shí)間對(duì)酶解液中多肽得率的影響在圖4中顯示。如圖4中可見(jiàn)，北極參隨著時(shí)間的增加，多肽得率先上升后下降，4 h時(shí)達(dá)到頂峰值。此現(xiàn)象出現(xiàn)可能由于酶進(jìn)一步將多肽轉(zhuǎn)變成氨基酸，所以引起得率下降。酶解反應(yīng)時(shí)間為4 h最優(yōu)。

圖4酶解時(shí)間對(duì)北極參酶解液多肽得率的影響

2.2.5加酶量對(duì)酶解液多肽得率的影響加酶量對(duì)酶解液多肽含量的影響在圖5顯示。加酶量對(duì)酶解液多肽得率的影響隨底物性質(zhì)的變化而變化。低于最佳加酶量，酶濃度低，使得水解不完全，過(guò)高又將造成水解過(guò)度，比較侯付景[22]等對(duì)海地瓜酶解工藝研究研究結(jié)果，加酶量在2%左右為最佳，比較本文數(shù)據(jù)1.74%與2.09% 加酶量多肽得率并無(wú)太大差別，所以選擇北極參的最適加酶量為2.09%。

2.2.6酶解條件正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)表3可得出，實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合為A1B4C4D4E4，即酶解溫度為45 ℃、pH值為8.0、料液比1∶5、酶解時(shí)間為6 h、加酶量為2.79%，在該條件多肽得率為1477%；通過(guò)極差分析得知，各因素影響酶解過(guò)程的主次順序是C（料液比）>A（酶解溫度）> B（pH值）>D（酶解時(shí)間）>E（加酶量）。所以理論最優(yōu)組合為A2B4C4D3E2，即酶解溫度為50 ℃、pH值為80、料液比1∶5、酶解時(shí)間為5 h、加酶量為2.09%。

由表4經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出最優(yōu)酶解工藝為最優(yōu)酶解工藝為A2B4C4D3E2，即酶解溫度為50 ℃、pH值為8.0、料液比1∶5、酶解時(shí)間為5 h、加酶量為2.09%。正交結(jié)果表明，酶解料液比和溫度為酶解反應(yīng)中重要因素，楊穎等[20]對(duì)于加拿大紅參的研究也證實(shí)酶解溫度是顯著影響因素，因此在生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格控制溫度及加水量，以確保酶解效果。蘇永昌[23]等以地瓜參為原料進(jìn)行酶解工藝的研究，其優(yōu)化條件與本文相差無(wú)幾，但多肽得率低于本研究結(jié)果，分析原因可能是本研究使用了復(fù)合酶，而蘇永康選用的為單一中性蛋白酶，這也說(shuō)明單一酶酶解結(jié)果不如復(fù)合酶酶解結(jié)果好。

2.3北極參酶解液氨基酸組成

由表5可知，北極參酶解液中的氨基酸含量豐富，必需氨基酸總量為21 081.54 mg/100 g，占氨基酸總量的24.6%，本文四種呈味氨基酸占氨基酸總量的42.1%，比袁文鵬[24]研究仿刺參中酶解提取物必須氨基酸和呈味氨基酸都高。有報(bào)道表明，許多哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)都離不開(kāi)精氨酸[25]，比較李亞嫻[14]等對(duì)澳洲禿參酶解液的研究，北極參酶解液精氨酸含量遠(yuǎn)高于澳洲禿參酶解液中精氨酸含量。Seifter[26]等人研究表明，精氨酸能夠促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合。北極刺參氨基酸含量豐富，適合各類(lèi)人群食用，尤其是兒童和創(chuàng)傷病人。研究表明該北極參酶解產(chǎn)物有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為海參多肽產(chǎn)品和海參調(diào)味產(chǎn)品的潛力。

北極參酶解液多肽分子量分布由圖6所示。由圖6可見(jiàn)北極參酶解液多肽分子量分布范圍為1 088～12 052 Da，Perez-Vega JA等[27]在海參中發(fā)現(xiàn)一種分子量小于3 000 Da的多肽類(lèi)物質(zhì)具有較好的ACE（血管緊張素轉(zhuǎn)換酶）抑制活性。王靜等人[28]研究表明海參酶解液中小于3 000 Da分子量的多肽抗氧化活性十分顯著。Zhou Xiaoqiu等人[29]仿刺參（Stichopus japonicus）水解，得到2 種分子量小于3 000 Da的低分子多肽，表明其具有治療胃癌和乳腺癌的功效。北極參酶解液分子量主要集中分布在1 088～4 071 Da之間，這說(shuō)明酶解液中多為9～34個(gè)氨基酸組成的多肽。

圖6北極參酶解液多肽分子量分布曲線(xiàn)

3結(jié)論

北極參枯草桿菌中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶酶解優(yōu)化條件為酶解溫度為50 ℃、pH值為8.0、料液比1∶5、酶解時(shí)間為5 h、加酶量為209%，其酶解液中多肽得率達(dá)15.38%。北極參酶解液多肽分子量分布范圍為1 088～12 052 Da，其具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成多肽產(chǎn)品和調(diào)味料的潛力。

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Enzymic hydrolyzing technologies for preparation of polypeptides from Cucumaria frondosa

WANG Di ，SONG Yuefan，Liu Shu，WU Long，Cong Haihua，GU Yue，WANG Qiukuan

（College of Food Science and Technology，Dalian Ocean University，National Research and Development Branch Center for Seaweed Processing，Key Laboratory of Fishery Product Processing and Utilization of Liaoning Province，Dalian 116023，China）

Abstract： Cucumaria frondosa prossesses high nutritional value and quality. It has a huge potential for application in development of polypeptide products. In this study，the sea cucumber Cucumaria frondosa was used as raw material and the peptide amount produced as determining indicator to carry out the orthogonal test for optimizing enzymolytic factors by using the combined enzymes of subtilism and flavourzyme，which included the enzyme amount added，enzymolytic time，temperature and pH value based on the findings of single factor experiments. The analysis of approximate composition for the raw material showed that the protein content was 95.03%，the lipid content was 1.76% and the ash content was 2.47%. The results obtained by orthogonal test indicated that the yield of polypeptides was 15.38% at optimized enzymolytic hydrolyzing conditions as follows： the material and water ratio of 1∶5 at temperature of 50 ℃，pH value of 8.0 and the amount of enzyme added of 2.09% for hydrolyzing time of 5 h. The total amino acids were measured for 85% of the dry weight of the hydrolysate. The polypeptide molecular weight distribution of the hydrolyzing product was estimated among 1 080～12 052 Da by Sephadex G-50.

Key words：Cucumaria frondosa； orthogonal test；hydrolyzing technology

（收稿日期：2017-02-13）