烏司他丁對膿毒癥大鼠的肺保護作用

蒲光軍，蒲桂新，鄧 佳(.四川省阿壩藏族羌族自治州人民醫(yī)院藥劑科，四川 馬爾康 64000；.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院麻醉科，四川 成都 6007)

烏司他丁對膿毒癥大鼠的肺保護作用

蒲光軍1，蒲桂新1，鄧 佳2
(1.四川省阿壩藏族羌族自治州人民醫(yī)院藥劑科，四川 馬爾康 624000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610072)

目的 建立大鼠膿毒癥急性肺損傷模型，觀察烏司他丁對大鼠急性肺損傷的保護作用及其機制。方法 SD大鼠120只，隨機數(shù)字表法分為膿毒癥組(CLP組)、烏司他丁組(UTI組)與假手術(shù)組(SHAM組)各40只；組內(nèi)分6 h組、12 h組、24 h組、48 h組各10只。建立膿毒癥模型，TUI組大鼠于手術(shù)30 min后經(jīng)大鼠尾靜脈注射烏司他丁100000 U/kg。光鏡下觀察肺組織病理改變及肺損傷Smith評分，透射電鏡下觀察大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)變化，Western-Blot法測定大鼠肺組織高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的表達。結(jié)果 CLP組大鼠肺損傷隨時間呈逐漸加重趨勢，術(shù)后48 h損傷達到高峰；UTI組大鼠肺損傷在24 h達到高峰；UTI組48 h時點肺損傷Smith評分明顯低于CLP組(P< 0.05)。CLP組和UTI組大鼠各時點肺組織超微結(jié)構(gòu)有不同程度損傷，UTI組損傷程度均較 CLP組對應(yīng)時點減輕。UTI組大鼠各時點肺組織中HMGB1的表達均明顯低于CLP組(P< 0.05)。結(jié)論 烏司他丁可以減輕膿毒癥性急性肺損傷大鼠肺組織的損傷程度，HMGB1參與了膿毒癥性急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展，烏司他丁通過抑制HMGB1的表達減輕了急性肺損傷的嚴重程度。

膿毒癥；急性肺損傷；高遷移率族蛋白B1；烏司他丁

膿毒癥是由于抗炎反應(yīng)綜合征和促炎反應(yīng)綜合征平衡失調(diào)的結(jié)果[1]，多種炎性因子介導(dǎo)的肺部失控性炎癥反應(yīng)是急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征發(fā)生發(fā)展的主要病理生理基礎(chǔ)。烏司他丁是一種從健康成年男性新鮮尿液中分離的糖蛋白水解酶抑制劑，不僅能抑制蛋白酶、糖以及脂類的多種水解酶活性，還能抑制一些炎性介質(zhì)的過度釋放，穩(wěn)定溶酶體膜，清除氧自由基以及抑制心肌抑制因子的產(chǎn)生[2～5]。研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁能夠使急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征患者的氧合改善，同時抑制病程的發(fā)生發(fā)展，降低疾病的死亡率[6]，但其具體作用機制未完全明確。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是核內(nèi)非組蛋白，研究表明HMGB1作為晚期炎癥介質(zhì)，與急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[7～10]。本實驗以大鼠為研究對象，建立膿毒癥急性肺損傷模型，觀察烏司他丁對急性肺損傷的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2015年9月至2016年3月，選擇SPF級雄性SD大鼠120只(購于成都達碩實驗動物有限公司)，6～8周齡，體重180～200 g，隨機數(shù)字表法分為膿毒癥組(CLP組)、烏司他丁組(UTI組)和假手術(shù)組(SHAM組)各40只。

1.2 膿毒癥模型的制備 CLP組大鼠:戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉后固定大鼠四肢，充分暴露腹部，剔除腹部毛發(fā)，消毒腹部手術(shù)區(qū)域，在腹壁正中處作一長約2 cm 的豎切口，進入腹腔后找到回盲部，分離出大鼠盲腸，采用中度膿毒癥結(jié)扎方法即50%結(jié)扎盲腸，用注射針頭于結(jié)扎端穿刺2次，擠出糞便少許，將回盲腸重新放回腹腔，逐層縫合腹部切口，手術(shù)結(jié)束后皮下注射生理鹽水10 ml/kg抗休克。UTI組大鼠:建模方法同 CLP 組大鼠，造模后30 min于大鼠尾靜脈注射烏司他丁100000 U/kg。假手術(shù)組大鼠:進入腹腔后回盲部不做盲腸結(jié)扎與穿刺，僅翻動腹腔內(nèi)腸道，手術(shù)結(jié)束后不注射生理鹽水。120只大鼠隨機分入 CLP 組、UTI組、假手術(shù)組。每組40只，組內(nèi)分6、12、24、48 h亞組各10只，在分別的時間點取材。UTI組大鼠手術(shù)30 min后由尾靜脈注射烏司他丁100000 U/kg進行干預(yù)，CLP組及假手術(shù)組大鼠手術(shù) 30 min后注射等量生理鹽水。

1.3 觀察指標

1.3.1 大鼠肺組織病理改變及肺損傷Smith評分 取大鼠右中肺部分肺組織用10%中性甲醛固定、酒精逐級脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡200倍視野下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化并進行肺損傷Smith評分[11]。

1.3.2 透射電鏡觀察大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)變化 取大鼠右下肺少許組織，生理鹽水沖洗干凈后用戊二醛溶液固定，經(jīng)過漂洗、固定、脫水、滲透、包埋、切片，用透射電鏡觀察大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.3 Western-Blot法測定大鼠肺組織 HMGB1的表達 取大鼠右上肺部分肺組織制備組織勻漿，提取總蛋白、測定蛋白濃度，制備SDS-PAGE膠，蛋白樣品變性、電泳，凝膠轉(zhuǎn)膜后曝光洗片，將所得結(jié)果用Image J軟件分析光密度值，將獲得的平均光密度(AOD)值代表蛋白表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理學(xué)改變及肺損傷Smith 評分 假手術(shù)組大鼠肺組織無明顯水腫。CLP組大鼠肺損傷呈逐漸加重趨勢，術(shù)后 48 h損傷達到高峰，可見肺組織水腫明顯，肺泡及肺間質(zhì)出現(xiàn)炎癥、出血，伴部分肺組織不張。UTI 組大鼠肺損傷在24 h達到高峰。UTI 組大鼠48 h時點肺損傷 Smith評分明顯低于 CLP組(P< 0.05)，見圖1～3；表1。

圖1 假手術(shù)組大鼠肺組織病理學(xué)改變(HE×200)

圖2 CLP組大鼠肺組織病理學(xué)改變(HE ×200) a:6 h；b:12 h；c:24 h；d:48 h

表1 三組大鼠各時點肺損傷Smith評分 (分)

2.2 三組大鼠肺組織電鏡超微結(jié)構(gòu)改變 采用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙雜法，假手術(shù)組電鏡下見肺泡細胞連接緊密，肺泡上皮細胞數(shù)量、形態(tài)基本正常，肺泡毛細血管膜結(jié)構(gòu)基本正常。CLP組大鼠 6、12 h時點可見肺泡細胞連接欠緊密，細胞器減少，肺泡上皮細胞數(shù)目減少；24、48 h時點可見細胞連接疏松，胞漿渾濁，細胞數(shù)量減少，肺泡毛細血管內(nèi)皮剝脫。UTI組大鼠各時點肺組織超微結(jié)構(gòu)有不同程度損傷，但損傷程度均較 CLP組對應(yīng)時點減輕，見圖4～6。

圖4 假手術(shù)組大鼠肺組織電鏡超微結(jié)構(gòu)(×10000)

圖5 CLP組大鼠肺組織電鏡超微結(jié)構(gòu) a:6 h；b:12 h；c:24 h；d:48 h(×10000)

2.3 三組大鼠肺組織 HMGB1表達的比較 假手術(shù)組大鼠各時點肺組織 HMGB1的表達均明顯低于CLP組(P< 0.05)，UTI 組大鼠各時點肺組織中HMGB1的表達均明顯低于CLP組(P< 0.05)，見圖7、表2。

圖7 三組大鼠肺組織 HMGB1的表達

表2 三組大鼠肺組織 HMGB1的表達 (/β-actin)

*與CLP組比較，P< 0.05

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，CLP組大鼠肺組織病理證實了急性肺損傷的產(chǎn)生，Smith評分逐漸升高，在48 h達到高峰，肺組織水腫明顯，肺泡及間質(zhì)出現(xiàn)炎癥、出血，伴部分肺組織不張；UTI組大鼠肺損傷Smith 評分在24 h時點達到高峰且峰值低于CLP組，在48 h時點肺損傷Smith評分明顯低于CLP組。同時電鏡超微結(jié)構(gòu)的比較也表明烏司他丁可以減輕膿毒癥性急性肺損傷大鼠肺組織的損傷程度。

HMGB1屬于高遷移率族蛋白(HMG)家族中的HMGB亞家族，其生物學(xué)活性主要是通過與其相應(yīng)受體的作用而實現(xiàn)的。多種炎性因子介導(dǎo)的肺部失控性炎癥反應(yīng)是急性肺損傷發(fā)生發(fā)展的主要病理生理基礎(chǔ)，這些炎癥因子通過一系列的級聯(lián)反應(yīng)參與急性肺損傷發(fā)生發(fā)展過程，HMGB1作為一種新的炎癥介質(zhì)，在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，CLP組大鼠肺組織中HMGB1的表達明顯高于假手術(shù)組，提示 HMGB1 可能在多個水平參與了膿毒癥性急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展。既往研究也發(fā)現(xiàn)，靜脈給予重組人HMGB1后可以導(dǎo)致大鼠急性肺損傷的發(fā)生，同時肺組織里 TLR4 表達上調(diào)，支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1 含量增加[12]；在肝臟缺血再灌注致急性肺損傷動物模型中，血漿中HMGB1表達上調(diào)，水平升高，同時在肺組織中 TLR4以及 HMGB1表達均上調(diào)[13]。

烏司他丁不僅能抑制蛋白酶、糖以及脂類的多種水解酶活性，還能抑制炎性介質(zhì)的過度釋放，穩(wěn)定溶酶體膜，清除氧自由基以及抑制心肌抑制因子的產(chǎn)生[2～5]。本研究發(fā)現(xiàn)，UTI組大鼠肺組織 HMGB1的表達明顯低于CLP組大鼠。既往研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁可以抑制一些炎性因子(比如 TNF-α、IL-6、ICAM-1等)的過度表達，降低炎性反應(yīng)程度，保護相關(guān)臟器功能[14，15]。

綜上所述，本研究通過中度膿毒癥結(jié)扎方法建立膿毒癥急性肺損傷大鼠的模型，并通過烏司他丁對膿毒癥急性肺損傷進行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)烏司他丁可以減輕膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織的損傷程度，HMGB1 參與了膿毒癥急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展，烏司他丁通過抑制HMGB1的表達減輕了急性肺損傷的嚴重程度。

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Protective effects of ulinastatin on lung injury in rats induced by sepsis

PUGuang-jun1，PUGui-xin1，DENGJia2
(1.DepartmentofPharmacy，People’sHospitalofAbaTibetanandQiangAutonomousPrefecture，Ma’erkang624000，China；2.DepartmentofAnesthesiology，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China)

DENGJia

Objective To establish a model of acute lung injury induced by sepsis and investigate protective effects of ulinastatin on acute lung injury and its mechanism.Methods One hundred and twenty SD rats were randomly divided into the CLP group，UTI group or sham group，40 in each group.Each group was further divided into 6 h，12 h，24 h and 48 h subgroups，10 in each subgroup.A model of acute lung injury induced by sepsis was established.The rats in the TUI group

ulinastatin 100000 u/kg after the surgery.We observed pathology changes in the lung tissues and recorded Smith scores.We also observed ultrastructure changes in the lung tissues under transmission electron microscope.Moreover，we detected the expression of HMGB1 in the lung tissues by using Western Blot method.Results In the CLP group，lung injury gradually increased and reached the worst at 48 h.In the UTI group，the lung injury reached the worst at 24 h.Smith scores in the UTI group at 48 h were significantly lower than that in the CLP group (P< 0.05).Ultrastructure damage of the lung tissues under transmission electron microscope in the UTI group was reduced than that in the CLP group at the same time point.The expression of HMGB1 in the lung tissues in the UTI group was significantly lower than that in the CLP group (P< 0.05).Conclusion Ulinastatin can reduce acute lung injury induced by sepsis in rats by inhibiting the expression of HMGB1.

Sepsis；Acute lung injury；HMGB1；Ulinastatin

鄧 佳

R631.2

A

1672-6170(2017)03-0024-04

2016-08-29；

2017-01-20)