微渠表面多孔羥基磷灰石支架體內異位成骨性的研究

呂欣榮，溫永梅 ，伍 佳，牟雁東，2(.西南醫科大學，四川 瀘州 646000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院口腔種植科，四川 成都 60072)

微渠表面多孔羥基磷灰石支架體內異位成骨性的研究

呂欣榮1，溫永梅1，伍 佳1，牟雁東1，2
(1.西南醫科大學，四川 瀘州 646000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院口腔種植科，四川 成都 610072)

目的 通過進行體內非骨區域植入實驗，評價微渠結構對多孔羥基磷灰石支架體內骨誘導性的影響。方法 選取4只比格犬的背部肌肉為實驗區，分為微渠結構的羥基磷灰石支架(HAS-G)組和非微渠結構的羥基磷灰石支架(HAS)組，每組各兩只犬，分別植入HAS-G和HAS。并于植入1月和3月時處死后取出背肌內植入樣本，進行組織學檢查、力學檢測；比較兩組支架內新骨形成情況，評價微渠結構對多孔羥基磷灰石支架體內異位成骨骨誘導性的影響。結果 兩組在背肌內均可形成新骨，但各個時間段內在HAS-G中形成的新生骨數量及新生血管數量均多于HAS。在抗壓強度測試中HAS-G也優于HAS。結論 與HAS比較，HAS-G表現出明顯的力學和生物學優勢，具有良好的應用前景。

微渠；多孔羥基磷灰石；支架；骨誘導性

目前，臨床上口腔種植治療時還存在著一些方面的不足與缺陷，像由于腫瘤、創傷或先天疾病導致的患者骨量不足以及無法直接有效地在頜骨上進行種植；此時，自體骨移植由于不存在免疫排斥反應且骨缺損修復能力較強，成為治療骨缺損的最佳選擇[1]；但由于頜骨有限的供骨量以及取骨會造成二次創傷從而極大限制了它在臨床上的應用。對于頜骨大面積缺損的患者，臨床迫切需要一種可批量生產但又具有良好力學及生物學性能的替代材料，以滿足的骨缺損修復需要。

隨著該領域的研究不斷發展和創新，支架材料這一基本構架被研究學者提出，同時利用支架材料已經成功引導及參與機體細胞增殖、分化和新生骨迅速形成的過程[2]。實驗研究發現，骨組織和新生血管的形成因生物支架表面形態的變化而受到影響，這主要是通過影響材料的微孔隙率、光滑度和支架的力學性能，進一步調控蛋白吸附及細胞生物學行為來實現的[3～5]；但材料形態與細胞生物學行為的關系目前研究尚不明確，其機制還需進一步探索。近些年來的研究表明細胞生物學行為，如：細胞粘附、鋪展、遷移、增殖以及分化，不僅與周邊微環境密切相關，也與材料表面的形態密切相關[6，7]；支架材料在臨床研究進展中受到阻礙，與其生物相容性和穩定性的不理想密切相關。最近有一些學者通過在支架表面構建溝槽結構，發現細胞能夠沿著溝槽方向進行取向性遷移及生長，這些實驗證明：不通過外加的化學修飾就可對細胞生物學行為及其功能進行調控[8]。

1 材料與方法

1.1 材料 微渠(HAS-G)和非微渠結構(HAS)的多孔羥基磷灰石支架由西南交通大學材料先進技術教育部重點實驗室制作及提供。健康比格犬4只，均為雄性，年齡為10～14個月，體重為9～10公斤，由四川省醫學科學院·四川省人民醫院動物中心提供。實驗過程嚴格按照2006年科技技術部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 方法

1.2.1 材料制備及表征 采用糖球造孔劑及濕化處理技術在多孔羥基磷灰石支架的宏孔孔壁表面構建規則的溝槽結構，糖球模板在濕度為70%的條件下處理24 h后所制備的多孔羥基磷灰石支架，宏孔孔壁表面上溝槽的寬度為25～30 μm，此為HAS-G。未經過濕化處理制備的HAS宏孔孔壁表面十分平整，為非微渠結構的多孔羥基磷灰石支架。采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察材料的孔結構及表面的微觀形貌，密度法測量多孔羥基磷灰石支架的孔隙率。試樣加工為Φ10 mm×8 mm的圓柱體，經高溫高壓滅菌后備用。

1.2.2 支架植入及取出 4只比格犬分為HAS-G和HAS兩組各2只；采用3%戊巴比妥鈉/生理鹽水混合麻醉劑1 ml/kg經靜脈注射麻醉，將犬只俯臥在手術臺上，背腰部位約30 cm×20 cm區域進行褪毛、清洗和消毒處理。常規消毒與鋪巾后，手術區沿背脊中線長軸切開皮膚皮下，在左右兩側背肌內各植入4個支架材料，各犬只共植入8個支架。縫合肌袋后用生理鹽水沖洗，分層縫合皮下組織，碘伏消毒。術后3 d內每天肌肉注射青霉素160×104單位及碘伏棉簽消毒傷口一周預防感染。植入后1、3個月時各處死2只動物取出所有支架材料，剔除周圍肌肉組織進行組織學制樣等檢測，見圖1。

圖1 支架材料植入背肌過程

1.2.3 組織學檢測 每組在術后1個月和3個月，分別處死一只比格犬，在各只比格犬背肌內隨機取出3塊樣品，經固定、脫鈣、石蠟包埋后，在長軸中心處平行于圓形截面做連續切片，經HE染色在光鏡下觀察兩組的新生骨及血管形成情況。

1.2.4 力學檢測 各組在其余支架材料中隨機挑選3塊(平行樣本)。去除支架外層包裹的軟組織，采用Instro5567 型材料萬能力學實驗機(美國英特斯朗)，進行抗壓強度檢測，負載強度為30 kN，抗壓加載速度0.5 mm/min，載荷精度±0.25%；計算平均值。每組測量3個平行樣品，材料均按管材進行計算。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件將所得數據均進行處理。抗壓強度測試的數據通過配對t檢驗進行分析。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 材料表征 HAS-G及HAS，孔隙率為80%左右，平均孔徑750～900 μm，大孔相互貫通，孔壁上有微孔，見圖2。HAS-G的宏孔孔壁表面具有25～30 μm溝槽結構，而HAS宏孔孔壁表面平滑。

圖2 羥基磷灰石支架的掃描電鏡圖片(SEM × 500) a：微渠支架；b：非微渠支架

2.2 組織形態學觀察 材料植入1個月和3個月后均觀察到骨誘導現象。植入1個月時，兩種多孔羥基磷灰石支架內部可見結締組織和血管長入，宏孔內形成薄的鈣化骨基質沉積，其中可見少量骨細胞(圖3a 和圖4a)。隨著材料植入時間的延長至3個月后，兩種多孔羥基磷灰石支架宏孔內的新生血管和新骨組織也明顯增加，組織學結果顯示所有支架的宏孔內有明顯的骨痂和新骨組織形成，且新骨組織多沿宏孔孔壁生長(圖3)。在形成的新骨上有明顯的骨陷窩存在，有大量的成骨細胞和多核破骨細胞。HE染色可見，在植入背肌3個月后，HAS-G較HAS形成的新生血管的數量及新骨形成量明顯更高(圖3b 和圖4b)。

圖3 HAS-G組織學圖片(HE×100) a：1月；b：3月； NB：新生骨；S：多孔羥基磷灰石支架材料；紅色箭頭示新血管；黑色箭頭示新生骨沉積

2.3 力學性能檢測 植入材料進行抗壓強度測試后，發現植入后材料的抗壓強度增強較植入前的材料有明顯增強，隨著植入時間延長至3個月后，HAS-G和HAS的抗壓強度均較一個月時有所增強，各組抗壓強度測試結果見表1。HAS-G和HAS植入體內后，一個月和三個月時HAS-G的抗壓強度均高于HAS，差異有統計學意義(P< 0.01)，且植入三個月后較植入一個月時支架材料的抗壓強度也有所增強，差異有統計學意義(P< 0.05)。

圖4 HAS組織學圖片(HE×100) a：1月；b：3月； NB：新生骨；S：多孔羥基磷灰石支架材料；黑色箭頭示新生骨沉積

表1 兩組HA支架體內植入后不同時期抗壓強度比較 (MPa)

a與未植入比較，P< 0.01

3 討論

頜骨骨缺損不僅給患者的生活來帶諸多不便，同時也對其精神造成極大的痛苦。近年來構建組織工程骨也是頜面骨缺損修復重建領域的一個研究熱點，是指利用組織工程的原理在體外構建具有骨誘導性的人工骨替代材料，用于修復骨缺損或替代喪失功能的骨組織[9]；構建組織工程骨有三要素：種子細胞、生長因子和支架材料[10]，其中支架材料在骨缺損修復的過程中，不僅為細胞的粘附、增殖及細胞質基質的沉積提供支架結構，同時也為新生骨組織及血管長入提供生長空間[11]。在關于支架內特異結構方面的研究，有的學者著手于孔徑尺寸與孔形態方面對骨組織再生影響的研究，指出理想的支架應當同時擁有宏觀孔隙及微觀孔隙相結合的多孔結構以促進細胞的粘附、新骨的形成及血管的生長[12]；有的學者則探討孔隙率與貫通性對骨組織再生的影響，提出較高的孔隙率有利于細胞，血管及組織更多的生長，通過調節支架的孔隙率可以優化其生物學功能，并調控新骨組織在支架內的形成能力[13]；另一些學者研究材料表面微納米結構對骨組織再生的影響，發現表面微納米結構的改變會影響材料表面的粗糙度、微孔隙率及力學性能，從而影響蛋白吸附及細胞行為進而調控組織的形成[14，15]。本實驗從材料表面的微納米結構這一方面出發，展開實驗。

近年來，很多研究資料表明在材料表面形成的溝槽結構可促使細胞沿溝槽取向性生長和遷移，調控細胞的生物學行為和功能時也無需添加額外的化學修飾[16]。Watari等[17]將表面光滑和表面有溝槽結構的硅基底與骨髓間充質干細胞共培養3天，發現RUNX2和BGLAP 的表達在具有溝槽結構的硅基底中有明顯增加，且BMP的表達也有顯著提高，因此認為溝槽結構可增強成骨誘導作用。Nadeem等[18]在氧化鋁陶瓷表面制備了寬度分別為10 μm和50 μm的溝槽結構，并與細胞共培養21天后。發現在寬度為50 μm的溝槽上有更多的類骨基質形成，得出50 μm的溝槽結構更有利于提高陶瓷材料植入體內骨整合性的結論。但這類研究多局限于在支架材料表面構建溝槽結構，而將此種結構整合于多孔支架宏孔的表面，進一步調控新生骨及血管的形成仍就是一個挑戰。本實驗從支架內構建微納米結構-微渠結構出發，探討微渠結構對羥基磷灰石支架體內骨誘導性的影響。

本實驗以多孔羥基磷灰石為支架材料，采用糖球造孔劑及濕化處理技術，將溝槽結構整合到三維多孔支架的表面；通過在比格犬背肌中實施體內實驗，采用組織學觀察、影像學檢測及生物力學檢測的方法對骨移植材料有效骨再生的情況進行評價[19]。在本實驗中，各個時間點的所有樣本均觀察到成骨現象，支架植入1個月后即可在支架內每個孔隙中看到一圈成骨細胞和薄層的骨基質，孔壁周圍有骨沉積。隨著植入時間的延長，多孔羥基磷灰石支架孔壁上的骨層不斷增厚，孔壁內新生骨、新生血管逐漸增多，但微渠組支架內的新生骨量及血管數量仍多于同期的非微渠組。經過改建的體內組織工程骨移植物的力學性能較單純多孔羥基磷灰石支架材料有明顯提高，植入后的材料脆性改善，韌性增強，在承受應力時不像易發生脆裂；三個月后非微渠組平均抗壓強度為1.658 MPa，而微渠組則增加至3.758 MPa，可以看出微渠組的力學性能的提升優于非微渠組。從組織形態學觀察、抗壓強度測試及骨密度值測定等數據的統計學分析，均可看出微渠和和非微渠結構的多孔羥基支架誘導新骨形成的差別。

綜上所述，微渠結構能夠提高多孔羥基磷灰石支架在體內成骨效果，對今后的植入材料內孔隙表面微型結構的研究具有一定指導意義，但其相關的生物學機制仍需進一步探討，臨床上應用的很多問題也亟待解決。

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Osteogenesis of micro-grooved patterns of porous hydroxyapatite scaffolds in non-osseous tissue

LVXin-rong1，WENYong-mei1，WUJia1，MUYan-dong1，2
(1.SouthwestMedicalUniversity，Luzhou646000，Sichuan，China；2.Oralimplant，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China)

MUYan-dong

Objective The study is aimed to evaluate the influence of the micro-grooved patterns of porous hydroxyapatite (HA) scaffolds on osteogenesis by means of implanting HA in non-osseous tissue.Methods The muscle tissue on the back of 4 Beagle dogs were taken as test area and divided into two groups (HAS-G and HAS)，2 dogs in each group.They were implanted with HAS-G and HAS，respectively.The specimens were respectively harvested at 1 and 3 months post operation for histological studies and mechanical measures.The osseous tissue formation at different times was compared between the two groups.The new bone grafts with micro-grooved patterns were evaluated.Results All kinds of scaffolds could construct new bone in muscle.However，blood vessels and number of new bone formed at each time in the HAS-G group was obvious more than those in the HAS group.The HAS-G was also better than HAS in compressive strength tests.Conclusion Compared to HAS，HAS-G show the obvious advantages of mechanics and biology.It could have brighter prospect to clinical application.

Micro-groove； Porous hydroxyapatite； Scaffold； Osteoinductive

四川省科技廳科研基金資助項目(編號：2016TD0008)

牟雁東

R783.1

A

1672-6170(2017)03-0028-04

2017-02-27；

2017-03-21)