籃式反應器發酵PCV過程中連續收獲病毒的可行性研究

趙立民

（廣東溫氏食品集團股份有限公司研究院，廣東新興 527400）

籃式反應器發酵PCV過程中連續收獲病毒的可行性研究

趙立民

（廣東溫氏食品集團股份有限公司研究院，廣東新興 527400）

應用NBS籃式細胞反應器高密度培養PK-15細胞，接種PCV病毒后，采取邊補加維持液邊收獲病毒液的方式，最終收獲相當于反應器約3倍體積的高滴度病毒抗原，生產效率明顯提升，證明該工藝具備可行性。

反應器；片狀載體；PK-15細胞；PCV；連續收毒

豬圓環病毒（porcine circovirus，PCV）屬圓環病毒科圓環病毒屬，有PCV1和PCV2兩個血清型，其中 PCV1為非致病性的病毒，PCV2為致病性的病毒，是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）、仔豬先天性震顫（CT）、豬皮炎腎炎綜合征（PDNS）等多種疾病的主要病原[1]，成為當前威脅我國養豬業的主要豬疾病病源之一。

目前國內獸苗企業通常采用轉瓶或反應器發酵技術生產PCV病毒抗原[2]，采用一次性收獲病毒的工藝，并使用氨基葡萄糖作為添加劑促進病毒擴繁。雖然該工藝均可獲得較高滴度的抗原，但是病毒液收獲量只相當于細胞培養體積，產率不高[3]。

籃式生物反應器是美國NBS公司產品，具有剪切力小、自動控制精準、操作簡單等特點[3]。與其配套使用的片狀載體內部具有網格狀結構，可以為細胞生長提供高生長面積/容積比，1g載體可提供1200cm2的生長面積，利于細胞高密度生長[4]。PCV是典型的細胞外分泌型病毒，在病毒復制的過程中宿主細胞不會立即裂解死亡，本文根據PCV的這一特點，采用籃式反應器與片狀載體大規模培養PK-15細胞，在收毒方法上進行了連續收獲病毒液的嘗試。

1 材料和方法

1.1 材料

1·1·1 細胞系與病毒

PK-15細胞，購自ATCC，100～150代；PCV2病毒，同業贈送，經特定處理后無致病性，120～180代。

1·1·2 細胞培養液

DMEM培養基（Gibco，高糖型），每升添加3.7gNaHCO3，用Millipore超純水溶解，稀HCl調節pH至7.2后，0.22um濾芯除菌過濾；使用時生長液添加8%新生牛血清（Hyclone），維持液添加1%新生牛血清（Hyclone）。

1·1·3 試劑

葡萄糖檢測試劑盒（南京建成），ELISA試劑盒（SERELISA PCV2，SYNBIOTICS），自配0.1mol/L NaOH溶液（滅活病毒用）。

1·1·4 主要設備與儀器

美國NBS籃式反應器（BIOFLO 510型，有效培養體積30～32L）及片狀載體（DISK），酶標儀（Thermo），紫外分光光度計（國產美譜達），CO2細胞培養箱（Thermo 3111型），超凈工作臺（蘇凈安泰）。

1·1·5 器具

細胞培養瓶（康寧75cm2），細胞工廠（康寧5層），電動移液器（Thermo）。

1.2 方法

先期采用細胞轉染的方法將PCV2病毒基因組導入PK-15細胞中，使之在培養瓶中能夠正常生長傳代。細胞傳代培養后2天，檢測細胞培養液PCV2抗原，確認陽性后利用細胞工廠擴大培養該細胞，作為反應器發酵的細胞種，期間重復檢測細胞培養液PCV2抗原，確保細胞能夠持續保持陽性結果。

籃式反應器裝填1000g片狀載體，原位高壓滅菌后接種PK-15細胞，接種密度2*105個/ml接種，采用灌注培養方式進行高密度培養。5～6天后，細胞達到最大生長密度，排空培養液，注入維持液。注入維持液后約36h后開始少量收獲病毒液，此后每隔12h取樣4℃保存，待檢病毒效價。收獲病毒液時應用籃式反應器自帶的蠕動泵，一邊收獲病毒培養液一邊向反應器內補加等體積的新鮮維持液，流速以能夠維持反應器內培養液的一定量的葡萄糖濃度為準，并保證反應器內的培養液體積維持在30～32L范圍內。每隔4h取樣檢測培養液中葡萄糖濃度，以便及時調整流速。當細胞日均耗糖量下降到0.5g/L以下，耗氧曲線有明顯下降趨勢時，即刻終止細胞發酵，收獲全部病毒液，放入4℃冷柜保存。反應器內注入事先配制好的0.1mol/L NaOH溶液，滅活罐體內病毒，防止實驗室內擴散。

將上述流程中維持的葡萄糖濃度分為1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L 3個梯度，分別進行PCV2病毒發酵，相應的實驗命名為實驗1、實驗2、實驗3，將測定的數據與常規方法（不更換維持液，直接收獲全部病毒液）實驗4做對比。所收獲的病毒溶液測定效價后全部使用0.1mol/L NaOH溶液做滅活處理。

病毒毒價測定采用ELLSA試劑盒法，結果用吸光度值表示，無單位[5]。

1.3 結果

表 病毒液毒價、收毒時間、收獲體積對比

圖 取樣毒價曲線圖

如下圖、表，實驗1～3的收獲病毒結束時間分別為125h、133h、136h，實驗4在接毒后72h到達毒價峰值，此時收獲最佳，如不收獲，毒價將持續降低。采用連續收毒方式，收獲病毒的時間延長近1倍，維持的葡萄糖濃度越高，收毒的時間維持越長；收獲的病毒液體積，是常規方法的3倍左右；其中實驗3收獲體積最多，達到96L。實驗1～3的病毒液平均毒價與常規方法接近，實驗2的平均毒價甚至超過了常規方法。實驗1～3中取樣的毒價峰值（96h左右）均高于常規方法的取樣峰值（72h），而且峰值出現的時間比常規方法推后了約24h。

1.4 討論

PCV屬于細胞外分泌型病毒，在病毒復制的過程中宿主細胞逐步而非立即死亡。在常規方法中，不進行換液操作，當病毒液毒價達到峰值即進行全部收毒下罐操作，而此時大部分宿主細胞尚有活力，依然有能力繼續復制病毒。采用連續收毒的方法，更換維持液后36h后即進行換液操作，因為新鮮培養基的注入，宿主細胞有較充足的營養得以進行正常的生理代謝活動，細胞活力要比同時期的常規方法高很多。另一方面，由于排出的培養液中含有病毒，同時期的病毒含量卻低于常規方法。但隨著時間的逐步積累，病毒含量逐步達到甚至超過常規方法的峰值，只是在時間上相應的推遲。由于細胞活力高，日耗糖量大，峰值會持續一段時間，此時連續收獲的病毒液體積最多，質量也較高。

另一方面，實現連續收毒工藝與片狀載體的關聯很大，該型載體內部具有親水性三維多孔隙，為宿主細胞提供較高的生長面積/容積比，宿主細胞附著在載體上能夠大量繁殖，相比傳統轉瓶等工藝技術其細胞密度提高很大。在片狀載體中，單個宿主細胞的生長形態呈球狀，多個細胞聚集成葡萄串狀，貼附在載體內部的纖維束上，形成立體結構。而PCV是一種細胞外分泌型病毒，在病毒復制擴增的過程中，病毒由外至內逐層侵蝕宿主細胞，使宿主細胞非同步死亡，即在一部分宿主細胞死亡的同時，另一部份宿主細胞仍存活并依舊復制病毒，正因為如此，才使本文中連續收獲病毒的工藝方法得以實現。

而在更為傳統的PCV2抗原生產中，采用的是細胞培養接種接毒同時進行，細胞長滿更換維持液后添加氨基葡萄糖試劑，以促進病毒在細胞內的增殖，由于氨基葡萄糖對細胞無法避免的毒性，細胞在短時間內會迅速的死亡，無法達到連續收獲病毒的目的。細胞種準備過程中因為細胞密度相對于反應器差距較大，其擴繁病毒的能力不足，但只要結果持續檢測為陽性，在反應器中隨著細胞密度的擴大與時間的累積，毒價會很快提升。

需要指出的是，本文所設定的各梯度試驗中的每項參數可能并非最佳。若想采用該工藝達到病毒效價與收獲量的更佳效果，需要對細胞生長狀態、單日耗糖量、換液流速、培養基葡萄糖添加量、接毒后葡萄糖濃度變化等一系列參數進行優化試驗，進一步提高單細胞產毒力，預計會有更大的突破進展。

2 結論

本文對應用籃式反應器連續收獲PCV2病毒的生產工藝進行了研究，實驗結果表明該方法具有良好的的可行性，采用該獲得的PCV2毒價與常規方法相當或更好，而收獲的病毒液體積達到了常規方法的3倍左右，能極大的提高生產效率。本實驗中的相關參數可以通過相似實驗繼續優化，使病毒液毒價與收獲量達到最佳效果。

[1] 廖園園，朱薇.豬圓環病毒2型Cap蛋白ELISA檢測方法的建立及初步應用[J].中國獸藥雜志，2012，46（6）：1-4.

[2] 何錫忠，李春華，倪建平，等.用微載體系統培養PK15細胞生產豬圓環病毒2型[J].上海農業學報，2010，26（4）：149-151.

[3] 張前程，張鳳寶，姚康德，等.動物細胞培養生物反應器研究進展[J].化工進展，2002，21（8）：560-563.

[4] 何錫忠，李春華，倪建平，蔣風英，鄒勇.微載體培養PK-15細胞試驗條件的優化.《動物醫學進展》，2010年第08期

[5] 李坤，國元，羅青平，商雨，等.豬圓環病毒Ⅱ型抗體間接ELISA檢測方法的建立.華中農業大學學報，2009年第06期

[6] 杜文娟. 表達豬圓環病毒2型（PCV2）Cap蛋白重組偽狂犬病病毒的構建及其生物學特性鑒定[D]. 中國農業科學院，2016.

[7] 趙立民，周慶豐，宋延華，等. 一種采用籃式反應器發酵制備豬圓環病毒的方法：CN, CN102703391A[P]. 2012.

[8] 解正剛，潘杰. 應用填充床式生物反應器制備豬圓環2型病毒原液[J]. 安徽農業科學，2013（34）：13246-13247.

[9] 杜文娟. 表達豬圓環病毒2型（PCV2）Cap蛋白重組偽狂犬病病毒的構建及其生物學特性鑒定[D]. 中國農業科學院，2016.

[10] 韓繼成，馬海彬，郭海寧，等. 歐洲型PRRSV、PCV2重組痘病毒疫苗灌注式生物反應器培養工藝的建立[J]. 中國病原生物學雜志，2016（11）：961-963.