NaClO脅迫下單核細胞增生李斯特菌WaX12及其sigB基因缺失突變株抗氧化脅迫相關功能基因表達比較

周 密，唐毓祎，王 旭，張煒佳，潘迎捷，趙 勇

（上海海洋大學食品學院，農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

NaClO脅迫下單核細胞增生李斯特菌WaX12及其sigB基因缺失突變株抗氧化脅迫相關功能基因表達比較

周 密，唐毓祎，王 旭，張煒佳，潘迎捷，趙 勇*

（上海海洋大學食品學院，農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

目的：探究單核細胞增生李斯特菌sigB基因對次氯酸鈉（NaClO）脅迫的調控作用。方法：在半致死濃度NaClO（3 mmol/L）脅迫下，比較該菌野生株WaX12與sigB基因敲除突變株的耐受程度及菌內的活性氧水平，并通過實時定量聚合酶鏈式反應技術（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）進一步觀察lmo1433、lmo0906、lmo2344、ohrR、lmo2770基因隨脅迫時間的轉錄水平變化。結果：野生株和sigB突變株的表型測定結果顯示，野生株比缺失株更耐NaClO脅迫，而且此現象在穩定期更加明顯；當脅迫時間達到30 min時，突變株內的活性氧水平增長率比野生株高出19.97%，進一步說明sigB基因對NaClO脅迫有一定的調控作用。RT-PCR結果表明，基因lmo1433、lmo2344和ohrR在野生株的表達水平顯著高于突變株（P＜0.01），而基因lmo0906、lmo2770的表達水平在野生株和缺失株中的差異并不明顯。結論：研究表明，單核細胞增生李斯特菌sigB基因對NaClO脅迫有一定的影響作用，且部分作用可能由激活部分調節機體氧化還原平衡的基因得以實現。

Key words: Listeria monocytogenes; sigB; sodium hypochlorite; oxidative stress; RT-PCR

次氯酸鈉（NaClO）是一種高效廣譜的含氯消毒劑，它具有極強的氧化活性，能夠有效的消滅細菌、真菌及病毒等微生物[1-2]。NaClO不僅能夠破壞機體中的DNA、脂質和蛋白質等生物分子，還能與細胞質中的Fe2＋發生芬頓反應，生成具有細胞毒素的活性氧類（reactive oxygen species，ROS）自由基[3-4]，從而造成細胞結構破壞甚至細胞凋亡。此外，次氯酸也是機體的有效先天性防御成分 之一。具有防御功能的中性粒白細胞在捕獲到入侵的細菌后，髓過氧化物酶以氯和過氧化氫為底物，催化產生次氯酸并迅速引發細菌的中毒反應[5]。

單核增細胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）（以下簡稱單增李斯特菌）是一種人畜共患食源性致病菌。它廣泛存在于自然界，對不良環境有極強的耐受能力[6]。免疫力低下的人群易受單增李斯特菌感染，感染后會引發腦膜炎、敗血癥、流產等癥狀[7]。食物貯藏和加工環節中的消毒不徹底會造成單增李斯特菌食物污染事件甚至引起爆發流行[8]。σB（sigB）因子是普遍存在于革蘭氏陽性菌中的環境調節因子。細胞通過調節級聯感應外界脅迫并傳遞信號以激活sigB因子，進而激活由sigB基因調控的基因組轉錄，隨后編碼蛋白執行特定功能以保護細胞抵御外界脅迫[9-10]。sigB基因 在單增李斯特菌抵御酸、低溫、超高壓及氧化等脅迫中扮演了重要的角色[11-14]。

在單增李斯特菌中，受sigB調控的基因有150多個，但其中大部分基因編碼的蛋白質功能仍不清楚[9]。同時，細菌抵御氧化脅迫是一個復雜的過程[15]，細胞中除一些可以直接分解氧化劑的酶如有機氫過氧化物酶（organic hydroperoxide resistance，Oh rR）外，細胞質中大量存在的低密度巰基蛋白不但可以中和入侵的ROS，還可以通過酰胺化修飾激活抗氧化脅迫蛋白表達[16-18]。此外，具有修復功能的蛋白質如硫氧還原蛋白、谷氧還原蛋白等能夠通過修復受損的核酸和蛋白質來維持氧化脅迫下細菌體內的代謝和蛋白質平衡[19-20]。ClO－對巰基的選擇性攻擊會加劇細菌內部的抗氧化脅迫蛋白聚合[21-22]。目前sigB基因對氧化脅迫的作用還沒有一致定論，一些研究表明sigB基因敲除菌株對氧化脅迫更加敏感[10,17]，而另一些研究則認為sigB基因敲除菌株對氧化脅迫有更強的耐受能力[23]。

因此，本研究利用從豬肉中分離的單增李斯特菌Lm-WaX12菌株及構建的sigB基因缺失菌株WaX12-ΔsigB，選取抗氧化脅迫相關基因：谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成酶基因lmo2770、GSH還原酶基因lmo1433、lmo0906、lmo2344以及OhrR基因ohrR，通過比較2 株菌的表型及基因表達差異來探尋單增李斯特菌sigB基因對NaClO脅迫的氧化調控作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

菌株WaX12為上海市蘆潮港菜市場購買的生豬肉中分離的野生致病菌，經過形態學分析、生化特性以及分子生物學鑒定，由上海海洋大學農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室保藏；WaX12-ΔsigB由王旭構建并提供[24]。

PrimeScriptt RT reagent反轉錄試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；RNA提取試劑盒 上海捷瑞生物工程公司；熒光定量SYBR Green Master 瑞士Roche公司；腦心浸液（brian heart infusion，BHI）培養基、PALCAM培養基 北京陸橋技術股份有限公司；NaClO、氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT） 美國Sigma公司；甘油、丙酮、甲醇、無水乙醇、冰乙酸等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

7500fast熒光定量儀 美國ABI公司；多功能酶標儀美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 培養條件

將單增李斯特菌WaX12及WaX12-ΔsigB接種至BHI液體培養基，37 ℃搖床培養過夜，按1∶100（V/V）接種于5 mL BHI液體培養基，37 ℃搖床培養備用。

1.3.2 生長曲線的測定

分別將制備好的單增李斯特菌液進行10 倍梯度稀釋，再接種于10 mL BHI試管中，使初始接種量為104～105CFU/mL。將接種后的BHI試管放入37 ℃培養箱，每2 h取樣涂布于PALCAM平板，計數測定WaX12及WaX12-ΔsigB的生長曲線。

1.3.3 NaClO半致死濃度確定

按照Primm等[25]的方法確定NaClO對單增李斯特菌WaX12及WaX12-ΔsigB的半致死濃度。將菌液接種到BHI液體培養基中，放入培養箱180 r/min、37 ℃培養16 h后離心，用生理鹽水漂洗并調OD600nm至0.630±0.025。用BHI稀釋菌液至OD600nm為0.025±0.005備用。在96 孔板內每孔加入100 μL BHI液體培養基，取100 μL的0.96 mol/L NaClO加入第1排孔板中并依次對NaClO進行2 倍稀釋。將10 μL稀釋好的菌液分別加入孔中，37 ℃過夜培養，測定菌體OD600nm，確定細菌的半致死濃度。

1.3.4 NaClO脅迫實驗

將菌體接種至BHI液體培養基，在培養箱中37 ℃條件下，180 r/min好氧培養5 h或12 h，得到處于對數期及穩定期的菌液，分別用生理鹽水漂洗并調整菌液濃度至OD600nm為0.63±0.02，取5 mL菌懸液，用半致死濃度的NaClO溶液按照不同的時間梯度（0、20、40、60、80、100 min）分別脅迫2 株菌，最后加入1 mL的0.5%的NaS2O3溶液作為猝滅劑終止反應。反應結束后，4 ℃、10 000×g離心1 min，將沉淀物用生理鹽水洗滌2 次，以去除殘余的NaClO。隨后，將細胞重懸于1 mL生理鹽水中，取10 μL菌液以不同的稀釋度點種于BHI培養基平板上測定單位體積菌落數。將平板放置在37 ℃條件下培養48 h，對平板上的菌落進行計數。設2 個平行樣。用Excel軟件計算平均值和標準偏差。

1.3.5 細菌內部的ROS水平測定

取0.1 mL的細菌懸浮液（OD600nm為1.0）于pH 7.5磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，與0.5 mL的NBT（1 mg/mL）混合，在37 ℃條件下培養30 min。加入0.1 mL HCl（0.1 mol/L）溶液，1 500×g離心10 min取沉淀，加入0.6 mL的二甲基亞砜以提取還原態的NBT，再加入0.8 mL PBS充分混勻，測定混合液的

1.3.6 引物設計及驗證

根據NCBI中已經公布的L. monocytogenes EGD-e全基因組序列，采用primer 5.0軟件設計ohrR、lmo1433、lmo0906、lmo2344、lmo2770基因的上游和下游序列的特異性引物，通過實時定量熒光PCR絕對定量的方法篩選出相關系數R2不小于0.95，且擴增效率在95%～120%范圍內的引物，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.7 總RNA的提取及cDNA的合成

分別提取經3 mmol/L NaClO脅迫不同時間（0、10、20、30 min）后的野生及突變株的菌體總RNA，RNA純化后用于cDNA的合成。將RNA逆轉錄成cDNA（2 μL RNA/20 μL體系），逆轉錄反應按照逆轉錄試劑盒的說明書進行，整個過程在冰上操作。

1.3.8 抗氧化脅迫功能蛋白基因的RT-PCR分析

表 1 RT-PCR引物Table 1 Primer sequences for RT-PCR amplification

引物見表1，實驗采用gap為內標基因[24]，內標基因與目的基因各設3 個平行反應管。實時定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）體系（20 μL）為：10 μL SYBR Solution、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL、無菌ddH2O 5 μL。反應條件：95 ℃ 15 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，循環40 次；95℃ 15 s，60 ℃ 1 min讀取熒光值，同時進行ROX值校正，最后進行熒光PCR產物溶解曲 線分析。

1.4 統計學處理

實驗結果為3 次重復的平均值，采用SPSS 19.0統計軟件進行實驗數據的統計與分析。檢驗水準為0.05，運用最小顯著性差異（least signi cant difference，LSD）法比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 NaClO脅迫下的不同生長期的單增李斯特菌WaX12及WaX12-ΔsigB的生長差異

圖 1 野生株WaX12及WaX12-ΔsigB的生長曲線Fig. 1 Growth curves of the wild-type strain (WaX12) and the mutant (WaX12-ΔsigB)

將WaX12及WaX12-Δ sigB接種至BHI液體培養基中，初始接菌量為104～105CFU/mL，每2 h取樣涂布于PALCAM平板，計數測定WaX12及WaX12-Δ sigB的生長曲線。如圖1所示，WaX12-Δ sigB與WaX12生長情況相似，表明sigB基因并不影響WaX12-Δ sigB菌株正常生長。

圖 2 不同濃度NaClO脅迫下野生株WaX12及WaX12-ΔsigB OD600nm的變化情況Fig. 2 OD600nmof the wild-type (WaX12) and the mutant (WaX12-ΔsigB) at different concentrations of NaClO stress

由圖2可知，單增李斯特菌WaX12對NaClO的抵御能力略高于WaX12-Δ sigB，但兩者的半致死濃度（3 mm ol/L）并無明顯差異。

圖 3 野生株和突變株在對數期（A）和穩定期（B）不同NaClO脅迫時間下的菌體濃度Fig. 3 Cell density of the wild-type and mutant strains at the log (A) and stationary (B) growth phases as a function of 0.03 mol/L NaClO stress time

由圖3A可知，脅迫60 min時，在對數時期的野生株的菌體濃度降低至（8.51±0.06）（lg（CFU/mL）），同一時期突變株的菌體濃度為（6.4 7±0.0 7）（lg（CFU/mL））。而在圖3B中，脅迫40 min時，穩定期的野生株和突變株的菌體濃度分別為（8.68±0.06）（lg（CFU/mL））、（6.16±0.23）（lg（CFU/mL））。實驗結果表明突變株對NaClO脅迫更加敏感，這一現象在穩定期更加明顯。

2.2 NaClO脅迫下的單增李斯特菌WaX12及WaX12-ΔsigB體內的ROS水平比較

圖4為穩定期野生株和突變株在不同脅迫時間下細菌內部的ROS水平增長率變化。脅迫時間為10 min時，兩菌胞內的ROS水平增長率無明顯差異。當脅迫時間為20、30 min以及40 min時，突變株胞內的ROS增長水平較野生株呈現明顯差異（P＜0.01）。其中在脅迫時間達到30 min時，兩者之間的ROS水平增長率差異達到最大，突變株內的ROS增長水平比野生株高出（19.97±3.14）%。

圖 4 野生株和突變株在不同NaClO脅迫時間下的ROS水平增長率變化Fig. 4 Percent increase in ROS levels in the wild-type and mutant strains as a function of NaClO stress time

2.3 NaClO脅迫下的單增李斯特菌WaX12及WaX12-ΔsigB與抗氧化脅迫相關基因表達水平比較

表 2 引物的擴增效率及擬合優度Table 2 Amplification efficiency values and fitness for target genes

在提取野生株和突變株在不同脅迫時間下（10、20、30 min）的總RNA后，以未經脅迫的細菌為參照，通過RT-PCR相對定量法觀察sigB、lmo1433、lmo0906、lmo2344、ohrR和lmo2770隨脅迫時間的轉錄水平變化。根據NCBI中已經公布的L. monocytogenes EGD-e全基因組序列，采用primer 5.0軟件設計ohrR、lmo1433、lmo0906、lmo2344、lmo2770基因的上游和下游序列的特異性引物，通過RT-PCR絕對定量的方法篩選出擬合優度R2不小于0.95，且擴增效率在95%～120%范圍內的引物（表2）。

圖 5 野生株和突變株在不同時間的NaClO脅迫下基因sigB（A）、lmo1433（B）、lmo0906（C）、lmo2344（D）、lmo2770（E）、ohrR（F）的相對表達水平Fig. 5 Relative expression levels of sigB (A), lmo1433 (B), lmo0906 (C), lmo2344 (D), lmo2770 (E), and ohrR (F) during different sodium hypochlorite stress in the wild-type and mutant strains

圖5 A為野生株sigB基因的表達情況，sigB基因的表達量在菌體受到脅迫后明顯增加，在脅迫30 min時相對表達量達到3.56±0.96。用0.03 mol/L NaClO分別脅迫野生株和突變株，結果發現，野生株的lmo1433基因表達量顯著高于突變株，差異在脅迫30 min時達到最大（圖5B）。而GSH還原酶基因lmo0906在野生株和突變株中的表達量差異并不明顯（圖5C）。圖5D中，NaClO脅迫下野生株的lmo2344基因的表達水平在脅迫20、30 min時均顯著高于突變株。GSH合成酶lmo2770基因在NaClO脅迫后兩株菌的表達量均較低且差異不明顯（圖5E）。此外，基因ohrR在WaX12野生株受到NaClO脅迫中有較高的表達量，NaClO脅迫30 min突變株的表達量（18.86±2.93）顯著高于缺失株的表達量（1.61±0.09）（P＜0.01）（圖5F）。

3 討 論

NaClO具有極強的氧化性，能夠迅速對微生物造成氧化損傷[1]。單增李斯特菌對外界的氧化脅迫有良好的適應性，其重要壓力調控基因sigB在菌體抵御不良環境的脅迫中扮演了重要的角色。然而，sigB基因對氧化脅迫，尤其對NaClO的脅迫的調控機理尚不明確。為了探究sigB基因在機體抵御NaClO的脅迫中的調控作用，比較了單增李斯特菌野生株WaX12與突變株在受到NaClO脅迫的表型及重要抗氧化脅迫基因的差異表達。

本研究發現，相同濃度NaClO（3 mmol/L）脅迫下，野生株的菌體濃度明顯高于突變株，這種差異在穩定期更加顯著。說明sigB基因在穩定期對NaClO脅迫有更強的耐受能力（圖3），同樣的現象也出現在單增李斯特菌面對酸、高滲透壓脅迫中[11,27]。在進一步的研究中，比較了野生株和突變株在NaClO脅迫下的胞內ROS水平增長率差異，發現NaClO脅迫下的野生株體內的ROS水平 增長率較突變株更低（圖4）。這一現象說明缺失株在NaClO脅迫下產生了更多的ROS。NaClO脅迫會導致細胞內部ROS水平增加，從而對細菌造成傷害，而細菌體內的防御機制能夠在一定程度上降低胞內ROS水平[19-20]。結果表明sigB基因對NaClO的部分調控作用可能通過激活調節機體氧化還原平衡基因來實現。

進一步研究了sigB基因對氧化脅迫的調控作用，提取了穩定期細菌在半致死濃度NaClO不同脅迫時間下的總RNA，運用熒光定量PCR的方法觀察野生株和突變株在NaClO脅迫下基因輪廓的變化。結果顯示，野生株的sigB基因在NaClO脅迫下的表達活躍（圖5A），說明sigB基因在NaClO脅迫中扮演了重要的角色。此外，GSH還原酶基因lmo1433lmo2344及OhrR基因ohrR在NaClO脅迫下的野生株中有較高的表達量，且表達量顯著高于突變株（P＜0.01）。而GSH還原酶基因lmo0906及GSH合成酶基因lmo2770表達量在野生株和突變株中均較低，且沒有顯著差異（圖5）。在單增李斯特菌中，GSH、OhrR、lmo2344是重要的抗氧化脅迫蛋白。GSH是一種低密度巰基蛋白，它不但能夠中和入侵的ROS，還可以通過谷氨酰胺化修飾激活抗氧化相關蛋白表達[16-18]。GSH合成需要GSH合成酶（lmo2770）的參與[28]，NaClO脅迫能夠將GSH氧化成氧化型谷胱甘肽（glutathione disulfide，GSSG），但這一反應是可逆的，GSSG在GSH還原酶（lmo1433、lmo0906）的作用下能重新生成GSH[17]。OhrR是一種重要的抗氧化脅迫蛋白，在枯草芽孢桿菌中，ohrR基因在NaClO脅迫后的表達量高達220 倍[17]。此外lmo2344是重要的抗氧化還原蛋白，能夠還原部分重要蛋白在氧化脅迫過程產生的二硫鍵以維持機體氧化還原水平平衡[29]。本研究發現，sigB基因雖對lmo0906和lmo2344轉錄無影響，但對ohrR、lmo2344及lmo1433有正向調控作用。因此推測，sigB對GSH合成沒有直接影響，而通過調控基因lmo1433而不是lmo0906還原NaClO脅迫造成的GSH氧化傷害。sigB基因除了本身參與抗NaClO脅迫外，在單增李斯特菌抗氧化體系中發揮了重要的作用。

4 結 論

本研究通過比較單增李斯特菌WaX12-sigB缺失株和野生株在抵御NaClO脅迫過程中基因表達輪廓差異，從基因角度初步闡釋了單增李斯特菌sigB基因對的調控作用。并發現sigB基因對GSH系統中谷氧還原蛋白和GSH還原酶基因lmo1433及重要的抗氧化基因ohrR有顯著的影響作用。不足的是，有研究表明sigB基因對細菌遭遇NaClO氧化脅迫的調控作用也可能受NaClO脅迫下產生的非氧化損傷影響[7]，而本研究只觀察了sigB因子對氧化脅迫基因的調控作用。后續將進一步從NaClO脅迫產生的非氧化損傷的角度完善單增李斯特菌sigB基因對NaClO脅迫的調控機制研究。

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Comparative Analysis of the Expression of Antioxidation Related Genes in Listeria monocytogenes WaX12 and Its sigB Gene Deletion Mutant under Sodium Hypochlorite Stress

ZHOU Mi, TANG Yuyi, WANG Xu, ZHANG Weijia, PAN Yingjie, ZHAO Yong*
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, Laboratory of Quality Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation, Ministry of Agriculture, College of Food Science & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Objective: The purpose of this study w as to explore whether the sigB gene palyed a regulatory role in Listeria monocytogenes (Lm) exposed to sodium hypochlorite stress. Methods: We studied the phenotypic changes and compared the percent increases in reactive oxygen species (ROS) levels in the wild-type Lm WaX12 and its sigB deletion mutant under sodium hypochlorite stress at the median lethal concentration (3 mmol/L). The changes in the transcriptional leve ls of lmo1433, lmo0906, lmo2344, ohrR and lmo2770 genes were investigated during sodium hypochlorite stress. Results: The wild-type strain p resented a stronger tolerance to sodium hypochlorite stress than the mutant, especailly during the stationary growth phase. The percent increase in ROS levels in the wild-type strain was 19.97% higher than that in the mutant after 30 min of sodium hypochlorite stress, confirming the regulatory role of the sigB gene in Lmunder sodium hypochlorite stress. Moreover, the relative expression levels of lmo1433, lmo2344 and ohrR genes in the wild-type strain were much higher than those in the mutant (P ＜ 0.01), as revealed by RT-PCR. No significant differences in the expression levels of lmo0906 and lmo2770 were found between the wild-type and mutant strains. Conclusion: The sigB gene plays an important regulatory role in Lm exposed to NaClO stress, which may be partially achieved by directly or indirectly activating some genes regulating the redox balance in the body.

2016-09-01

國家自然科學基金面上項目（31271870；31571917）；上海市科委計劃項目（14DZ1205100；14320502100）；上海市科技興農重點攻關項目（滬農科攻字2014第3-5號；2015第4-8號）；上海市科委工程中心建設項目（11DZ2280300）

周密（1991—），女，碩士，研究方向為食源性致病菌。E-mail：meechyou@163.com

*通信作者：趙勇（1975—），男，教授，博士，研究方向為食源性致病菌的快速檢測技術、高效防控技術及其風險評估。E-mail：yzhao@shou.edu.cn

10.7506/spkx1002-6630-201710009

TS20

A

1002-6630（2017）10-0049-06

周密, 唐毓祎, 王旭, 等. NaClO脅迫下單核細胞增生李斯特菌WaX12及其sigB基因缺失突變株抗氧化脅迫相關功能基因表達比較[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 49-54. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710009. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Mi, TANG Yuyi, WANG Xu, et al. Comparative analysis of the expression of antioxidation related genes in Listeria monocytogenes WaX12 and its sigB gene deletion mutant under sod ium hypochlorite stress[J]. Food Science, 2017, 38(10): 49-54. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710009. http://www.spkx.net.cn

單增李斯特菌；sigB；NaClO；氧化脅迫；RT-PCR