洋金花總堿對人肺腺癌A549細胞EMT過程中E-cad表達的影響

譚曉麗呂曉東王真

·論著·

洋金花總堿對人肺腺癌A549細胞EMT過程中E-cad表達的影響

譚曉麗1呂曉東1王真2

目的觀察洋金花總堿對轉化生長因子-β1（TGF-β1）誘導的A549細胞向間質細胞轉化（EMT）過程中E-鈣黏蛋白（E-cad）表達的影響。方法將體外培養的A549細胞隨機分為空白對照組，TGF-β1組及洋金花總堿低、中、高濃度藥物組，分別作用24、48、72h后，通過Western-blot及RT-PCT檢測各組A549細胞E-cad表達的變化。結果24、48、72hE-cad表達，空白對照組分別為（1.49±0.12）、（2.52±0.07）、（2.58±0.21）；TGF-β1組分別為（0.66±0.01）、（0.50±0.13）、（0.52± 0.08）；洋金花總堿低、中、高濃度藥物組分別為24h[（0.67±0.12）、（0.67±0.12）、（1.12±0.05）]、48h [（0.70±0.28）、（1.02±0.08）、（1.10±0.13）]、72h[（0.68±0.04）、（1.25±0.11）、（1.30±0.09）]。與空白對照組比較，TGF-β1組和洋金花總堿低、中、高濃度藥物組的E-cad表達均明顯減少（P<0.01）；與TGF-β1組比較，各時間段的洋金花總堿低濃度組E-cad表達無明顯變化（P>0.05），但48、72h洋金花總堿中、高濃度組E-cad表達明顯增加（P<0.01）；與24h低濃度藥物組比較，24h中濃度藥物組E-cad表達差異無統計學意義（P>0.05），但作用48、72h后，中濃度藥物組的E-cad表達明顯增加（P< 0.01），而高濃度藥物組3個時間點的E-cad表達均明顯增加（P<0.01）。與中濃度藥物組比較，24h高濃度藥物組E-cad表達增加（P<0.05），48、72h高濃度藥物組E-cad表達差異無統計學意義（P> 0.05）。與空白對照組比較，不同濃度作用的洋金花總堿藥物組使E-cad mRNA表達上調（P<0.01），并且在72h及高濃度時最明顯（P<0.01）。結論洋金花總堿通過增加上皮標志物E-cad表達，可抑制A549細胞的上皮間質轉化。

肺腺癌細胞；A549細胞；洋金花總堿；上皮細胞間質化；E-cad

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種慢性、不可逆性的致命性肺疾病，而肺泡上皮細胞向間質細胞轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被認為是肺纖維化的重要病理生理機制之一[1]，研究EMT及其相關信息傳導通路可為抑制肺纖維化進程提供有效策略。有研究表明，在眾多參與EMT的細胞因子中，轉化生長因子-β1（transforming growthactor-β1，TGF-β1）起著關鍵作用[2]。E-鈣黏蛋白（E-Cadherin，E-cad）是上皮細胞跨膜蛋白，特異性較高，常用于標志性表示上皮細胞。x藥理研究發現洋金花的主要有效成分為東莨菪堿[3]，表現為抑制毒蕈堿樣作用。實驗證實，M受體阻滯劑噻托溴胺能濃度依賴性抑制乙酰膽堿、TGF-β1誘導的成纖維細胞的增殖[4]。本研究觀察洋金花總堿對TGF-β1誘導的A549細胞EMT過程中E-cad表達的變化，為洋金花總堿抗纖維化作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料肺腺癌細胞株A549（購自中國醫學科學院基礎研究所細胞庫）；洋金花總堿（來源于浙江中醫藥大學藥學院）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；TGF-β1（美國PeproTech公司）；Ham'F12培養基、高糖DMEM培養基(美國Life Technologies公司)，E-cad兔抗人一抗（美國Epitomics公司）；GAPDH單克隆抗體（杭州達文生物有限公司）；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（杭州達文生物有限公司）；SDSPAGE蛋白上樣緩沖液（5X）、BCA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Trizol Reagent（美國Invitrogen生命技術有限公司）；Prime Script RT Master Mix試劑盒、DEPC水（TaKaRa，大連寶生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養肺腺癌細胞株（A549）先常規傳代于含10%胎牛血清Ham'F12培養基中，逐漸過渡至含10%胎牛血的高糖DMEM培養基中，37℃，5%CO2及飽和濕度條件孵箱中培養，用0.25%胰酶-EDTA消化，傳代，取增殖旺盛、生長狀態良好的細胞用于實驗研究。

1.2.2 細胞分組和處理當細胞生長融合至70%～80%，用無血清培養基饑餓24h，使細胞靜止于同步期，隨機將細胞分為空白對照組、TGF-β1組（5ng/ mL）及洋金花總堿低濃度組（50g/mL+5ng/mL TGF-β1）、中濃度組（100g/mL+5ng/mL TGF-β1）和高濃度組（200g/mL+5ng/mL TGF-β1），分別作用24、48、72h。洋金花藥物濃度梯度由前期MTT測得。

1.2.3 Western blot法檢測分別在低、中、高濃度洋金花總堿作用細胞24、48、72h時間點收集各組細胞，按試劑盒說明書提取細胞總蛋白：棄培養液，加入細胞蛋白裂解液，BCA試劑盒蛋白定量。各組標本加入蛋白上樣緩沖液行SDS-PAGE電泳，電轉移至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉1h，兔抗人一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（二抗）室溫2h，ECL發光顯色，采用凝膠成像系統成像，利用圖像分析軟件進行分析，以GAPDH為內參，計算目的蛋白與內參灰度的相對比值。實驗重復3次。

1.2.4 RT-PCR檢測分別在低、中、高濃度洋金花總堿作用細胞24、48、72h時間點收集各組細胞，進行以下處理。總RNA提取：按說明書，用Trizol法分別提取各組A549細胞總RNA，并計算總RNA濃度，-20℃保存備用。逆轉錄合成cDNA：加入5倍Prime Script RT Master Mix配置成10μL的逆轉錄液，操作在冰上進行，在逆轉錄儀上設置程序，37℃，15min；85℃，5s；4℃，5min，反應所得即為cDNA。RTPCR擴增反應：按說明書配置每份10μL的反應體系，合成E-cad和GAPDH的兩對引物分別為：E-cad，上游引物5'-TTCTGGAAGGAATGGAGGAGTC-3'，下游引物5'-ACCTGGAATTGGGCAAATGTG-3（'120kd）；GAPDH：上游引物5'-GGTCTCCTCTGACT-TCAACA -3'，下游引物5'-AGCCAA-TTCGTTGTCA-TAC-3'（36kd），在PCR儀上進行擴增反應，反應條件：95℃30s 1個循環；95℃5s，60℃34s，40個循環；95℃15s 1個循環；60℃1min 1個循環及95℃15s 1個循環。所得的RQ值即為目的基因與內參的相對比值。實驗重復3次。

1.3 統計學方法應用SPSS17.0統計軟件進行數據處理，所有數據以表示，正態分布數據用One-way ANOVA檢驗，予以方差齊性檢驗，多組均數間比較采用單因素方差分析，方差齊時組間比較用LSD法，方差不齊時組間比較用Tamhane's T2法，P<0.05說明差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 各組24、48、72h E-cad蛋白表達比較與空白對照組比較，24、48、72h時間點TGF-β1組與洋金花總堿低、中、高濃度組的E-cad表達均明顯減少，差異有統計學意義（P<0.01）；與TGF-β1組比較，各時間段的洋金花總堿低濃度組E-cad表達無明顯變化（P>0.05），洋金花總堿中、高濃度組48、72h E-cad表達明顯增加（P<0.01）；與洋金花總堿低濃度組比較，作用24h時，洋金花總堿中濃度組的E-cad表達差異無統計學意義（P>0.05），但48、72h中濃度藥物組的E-cad表達明顯增加（P<0.01），洋金花總堿高濃度組則3個時間點的E-cad表達均明顯增加（P< 0.01），說明洋金花總堿對細胞的作用呈濃度依賴性和時間依賴性。與洋金花總堿中濃度組比較，24h時洋金花總堿高濃度組E-cad表達增加（P<0.05），洋金花總堿高濃度組48、72h時間點的E-cad表達差異無統計學意義（P>0.05），見表1、圖1。

2.2 各組24、48、72h E-cadmRNA表達比較與空白對照組比較，3個時間點TGF-β1組E-cadmRNA表達均下降，差異有統計學意義（P<0.01）。與TGF-β1組比較，洋金花總堿各濃度組每個時間點的E-cad mRNA表達隨藥物濃度的增加而增多（P<0.01），且隨著作用時間延長，E-cadmRNA表達明顯增多。洋金花總堿高濃度組72h時間點的表達達高峰，與24h時間點比較，差異有統計學意義（P<0.01），見圖2。

表1 各組洋金花總堿作用24、48、72h后E-cad的蛋白表達比較

表1 各組洋金花總堿作用24、48、72h后E-cad的蛋白表達比較

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與TGF-β1組比較，△P＜0.01；與洋金花總堿低濃度組比較，▲P＜0.01；與洋金花總堿中濃度組比較，○P＜0.05；E-cad：E-鈣黏蛋白；TGF-β1：轉化因子-β1

圖1 各組細胞在藥物作用24、48、72h后E-cad表達

圖2 各組24、48、72h E-cadmRNA表達比較

3 討論

肺纖維化發病多從肺泡炎開始，以纖維化告終，作為病變開始的靶細胞除了血管內皮細胞外，還有相當數量的肺泡細胞，特別是Ⅱ型肺泡上皮細胞。A549細胞與來源于人的原代Ⅱ型肺泡細胞,在病毒誘發的損傷中TGF-β1mRNA的表達水平、凋亡相關因子Caspse3/7的活性及細胞增殖能力均接近[5]，誘導它增殖和EMT可以模擬Ⅱ型肺泡上皮細胞在病理狀態下參與體內肺纖維化形成過程。

EMT是指上皮細胞在形態學上發生間充質細胞表型的轉變，并獲得轉移能力的過程，很久以來一直被認為在胚胎發育和惡性腫瘤的細胞轉分化中起主導作用。近年發現，EMT與肺纖維化也關系密切，體外培養的肺泡Ⅱ型上皮細胞可以通過EMT而成為肌成纖維母細胞（MFb）的部分來源[6]；特發性肺纖維化患者的活檢標本中，也觀察到EMT參與肺纖維化的形成[7-8]。TGF-β1作為體外誘導EMT的關鍵因子，早期變化即是E-鈣黏蛋白表達受到抑制，細胞間緊密連接被破壞，上皮細胞喪失黏附特性，逐漸從基底膜上脫落；然后胞質內細胞骨架進行重排，表達新的表型蛋白如α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），胞質內肌絲也從上皮型的角蛋白（cytokeratin）轉變為間質細胞的波形蛋白（vimentin）[9-10]。

姜毅等[11]使用不同濃度的槲皮素干預TGF-β1誘導的A549細胞，用Western blot及RT-PCR檢測上皮間質轉化標志物E-cad、Vimentin的表達變化，結果顯示，一定濃度的槲皮素能抑制A549細胞的增殖，并在基因和蛋白水平增加E-cad表達，降低Vimentin表達，從而抑制A549細胞向間質轉化。本實驗研究顯示洋金花總堿能在蛋白和基因水平增加E-cad的表達，且呈濃度依賴性和時間依賴性，說明洋金花總堿能在一定程度上抑制A549細胞的EMT過程，從而減少成纖維細胞的來源，延緩肺纖維化進程。

洋金花臨床廣泛用于呼吸系統疾病，我們研究發現，洋金花總堿能明顯增加TGF-β1誘導下人肺腺癌細胞A549的上皮細胞表達，但同期未做相應的體內實驗，且關于洋金花總堿分子水平的研究文獻較少，故具體的作用靶點還需要后期更深入的研究。

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（收稿：2016-09-12修回：2016-10-07）

Effect of Yangjinhua Alkaloids on the Expression of E-cad in Human Lung Adenocarcinoma Cell LineA549 Cells during EMT

TAN Xiaoli1,LU Xiaodong1,WANG Zhen2.1 Department of Respiratory,the First Hospital of Jiaxing,Zhejiang,Jiaxing(314000),China;2Department of Respiratory,Zhejiang Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo observe the E-cad expression changes in A549 cells during TGF-β1-induced EMT after Yangjinhua alkaloids treatment.MethodsA549 cells in vitro cultured were randomly divided into blank control group,TGF-β1 group,low,medium and high dose of Yangjinhua alkaloids group.The change of cell morphology and the expression of E-cad were observed by western blot and RT-PCR after 24,48 and 72 hours,respectively.ResultsThe expressions of E-cad at 24,48 and 72 hours after treatment were 1.49±0.12,2.52±0.07, 2.58±0.21 in blank control group,0.66±0.01,0.50±0.13,0.52±0.08 in TGF-β1 group,0.67±0.12,0.67±0.12,1.12± 0.05 in low dose of Yangjinhua alkaloids group,0.70±0.28,1.02±0.08,1.10±.13 in medium dose of Yangjinhua alkaloids group and 0.68±0.04,1.25±0.11,1.30±0.09 in high dose of Yangjinhua alkaloids group.Compared with those in blank control group,the expressions of E-cad in three Yangjinhua alkaloids groups were significantly decreased（P<0.01）.Compared to those in TGF-β1 group,the expressions of E-cad at 24,48 and 72 hours in lowdose of Yangjinhua alkaloids group were not different（P>0.05）,but the expressions of E-cad at 48 and 72 hours in medium and high doses of Yangjinhua alkaloids groups were obviously increased（P<0.01）.Among three Yangjinhua alkaloids groups,the expression of E-cad at 24 hin low dose group did not differ from that in medium dose group,but the expression of E-cad at 48 and 72 hours in medium dose groups were significantly increased（P<0.01）,and the expression of E-cad in high dose group were higher at each time point（P<0.01）;compared to those in medium dose group,the expression of E-cad at 24 h in high dose group were raised（P<0.05）, but no significant difference was noted between two groups at 48 and 72 hours（P>0.05）.Compared to blank control group,three Yangjinhua alkaloids groups all had higher level of E-cad mRNA（P<0.01）,and the level of E-cad mRNA reached the peak at 72 hours after treatment or in high dose group（P<0.01）.ConclusionYangjinhua alkaloids can inhibit the EMT process of A549 cells by increasing the expression of the epithelial marker E-cad.

lung adenocarcinoma cell;A549 cells;Yangjinhua alkaloids;epithelial-mesenchymal transition;E-cad

浙江省中醫藥科技計劃項目（No.2012ZB049）

1浙江省嘉興市第一醫院呼吸科（嘉興314000）；2浙江省中醫院呼吸科（杭州310006）

王真，Tel：13605801386；E-mail：wangzhen610@sina.cn