魚腥草抗單純皰疹病毒作用機制研究

周良斌

（黃岡職業技術學院，湖北黃岡438002）

科學實驗研究

魚腥草抗單純皰疹病毒作用機制研究

周良斌

（黃岡職業技術學院，湖北黃岡438002）

利用體外試驗研究魚腥草是否對第二型單純皰疹病毒（HSV-2）感染具有抑制作用，并進一步探討其抑制單純皰疹病毒的效用與機制。結果表明：利用溶斑減少試驗發現，魚腥草初萃取物可抑制HSV-1、HSV-2及阿昔洛韋抗藥性HSV-1（HSV-AR）。將魚腥草初萃取物依據分子量分成1000 Da以下、1000～3000 Da、3000 Da以上三部分，發現三部分皆具有抗病毒的成分，其中以1000 Da以下的部分抑制效果最好。分析六種魚腥草成分作用發現，B、E及F具有抗HSV活性。其中B可以同時抑制病毒進入細胞以及NF-κB活化。可見，魚腥草可直接和病毒顆粒作用而抑制病毒進入細胞。在病毒進入細胞后，魚腥草通過抑制細胞NF-κB活化而減少NF-κB結合至HSV的ICP0基因啟動子而抑制HSV復制。

單純皰疹病毒；魚腥草；抗病毒作用

單純皰疹病毒屬于皰疹病毒科中的α皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae），由于其表面蛋白質抗原性有所不同而可區分為兩種血清型，即第一型單純皰疹病毒（HSV-1）與第二型單純皰疹病毒（HSV-2）。以往抗病毒藥物多半重于西藥開發，近年來中草藥對抗病毒功效已慢慢被注意。

本試驗利用體外試驗方法找出魚腥草抗單純皰疹病毒效用與機制后，測試魚腥草是否對第二型單純皰疹病毒及阿昔洛韋抗藥性HSV-1感染也具有抑制作用，并進一步探討其抑制單純皰疹病毒機制。

1 材料與方法

1.1 萃取中草藥 清洗魚腥草后，加入適量蒸餾水，以攪拌切割機打碎，分別以下列比例配制：魚腥草100 g+水1 L，以小火煮沸至體積400 mL。3000 r/min離心10 min，收取上清液。藥液再分別以棉花、100目金屬網、0.2 μm過濾膜依序過濾。分裝至15 mL離心管，置于-70℃保存備用。經煎煮的藥液冷凍干燥處理后，再秤重配制成100 mg/L濃度。

1.2 魚腥草內含成分制備 購買不同魚腥草成分的化合物A、B、C、D、E及F。所有藥物皆溶于二甲亞砜溶液（DMSO）。

1.3 細胞培養 將體外連續培養細胞株Vero細胞 （猴腎細胞）、A549細胞 （人類肺癌細胞）以及HEp-2細胞（人類喉癌細胞）由液態氮中取出后快速解凍，經離心去除冰凍保存液，加入含有胎牛血清的細胞生長培養基，移至細胞培養瓶中，置于含5%CO2的37℃培養箱進行培養。細胞每3～4 d進行一次繼代培養，當細胞生長形成完整的單層細胞時，將培養基移除，用磷酸鹽緩沖液清洗兩次后，加入胰蛋白質酵素作用5～10 min，見細胞脫落即可加入生長培養基，細胞經充分混合均勻后，以1∶4的比例分裝于新的培養瓶中。或計數細胞數目后，稀釋成適當的濃度，供培養病毒或后續測試用。

1.4 病毒培養 將人類單純皰疹病毒HSV接種于細胞，置于37℃使病毒吸附于細胞，1 h后，換上新鮮的維持培養基，置于內含 5%CO2的37℃培養箱培養。直至細胞病變大于75%即可收取病毒，病毒液于4℃、5000 r/min（Hitachi SCR20B）離心30 min以移除細胞沉淀物，去除細胞的病毒培養上清液，以少量分裝于小安瓶內，保存于-80℃下。

1.5 MTT試驗測試中草藥的細胞毒性 將3×104的Vero細胞于37℃、5%CO2培養箱隔夜培養于96孔盤。稀釋魚腥草粗萃取液，最高濃度的魚腥草與2×濃度的E-4（2×EMEM含4%FBS）以1∶1等體積稀釋，其他濃度以E-2（EMEM含2%FBS）做2×序列稀釋。緩慢吸去細胞培養基，加入100 μL中草藥稀釋液，細胞對照組則加100 μL E-2，37℃培養3 d。加入MTT（5 mg/mL PBSA）25 μL/well，置于37℃2 h。加入裂解液100 μL/well，37℃2 h后，移至室溫放置24 h。以OD570nm分析。

1.6 溶斑試驗 細胞濃度調整到8×105cells/mL，放入6孔細胞培養盤（1 mL/孔），37℃培養 24 h。稀釋病毒，以E-2將HSV稀釋。緩慢吸去細胞培養基，加入 100 μL病毒稀釋液/well，細胞對照組則加100 μL E-2，置于37℃使病毒吸附1 h，準備含有2%纖維甲醚（MC）的覆蓋介質溶液與2×E-4以1∶1的比例混合，加入2 mL/well，37℃培養3 d。加入1 mL 10%福爾馬林溶液，固定1 h。倒掉所有覆蓋液體，滴上1%crystal violet，染色10 min。以清水溫和潤洗，計數溶斑（PFU）

PFU/mL=（溶斑平均數）×（1/接種體積）×（1/稀釋倍數）。

1.7 溶斑減少試驗 細胞濃度調整度到5×105個/mL，放入6孔細胞培養盤，37℃培養24 h。稀釋病毒，以E-2調整病毒濃度至100 PFU/100 μL。緩慢吸去細胞培養基，加入100 μL混合液，細胞對照組則加100 μL E-2，病毒對照組直接加入病毒，37℃使病毒吸附1 h。加上含有不同濃度魚腥草粗萃取液的加入第二種溶液，37℃培養3 d。加入1 mL 10%福爾馬林溶液，固定1 h。倒掉所有覆蓋液體，滴上1%crystal violet，染色10 min。以清水溫和地潤洗，計數溶斑。

1.8 病毒前處理試驗 將5×105個/mL的病毒細胞在37℃、5%CO2的培養箱隔夜培養于6孔盤。隔天在病毒感染前3 h，先將HSV-1用培養液稀釋并加入不同濃度的魚腥草使病毒力價為100 PFU/100 μL。將病毒和魚腥草在室溫下作用3 h。之后將細胞培養液移除，加入已和魚腥草作用過的病毒100 μL，在37℃下感染1 h，然后吸去病毒液，以2 mL PBS潤洗細胞三次。再加入2 mL不含魚腥草的MC覆蓋液。3 d后讀取細胞溶斑數。再將加藥物的試驗組與病毒控制組做比較。

1.9 細胞前處理試驗 將5×105個/mL的病毒細胞于37℃、5%CO2培養箱隔夜培養于6孔盤。隔天在病毒感染前3 h，先將孔內培養液換成含有不同濃度魚腥草的培養液，在37℃下作用3 h。3 h后移去上清液，再以2 mL PBS潤洗細胞三次。每孔感染100 PFU/100 μL的HSV-1，在37℃下感染1 h，之后吸去病毒液，再以2 mL PBS潤洗細胞三次。再加入2 mL不含魚腥草的MC覆蓋液。3 d后讀取細胞溶斑數。再將加藥物的試驗組與病毒控制組做比較。

1.10 病毒吸附試驗 將5×105個/mL的Vero細胞于37℃、5%CO2培養箱隔夜培養于6孔盤。第2天于試驗前先將6孔盤置于4℃預冷，1 h后吸去培養液每孔加入力價含100 PFU/100 μL HSV-1病毒與特定濃度魚腥草的混合液100 μL，病毒控制組則加入不含藥物的病毒液100 μL，再將6孔盤置于4℃1.5 h，病毒于4℃下只能吸附在細胞表面，無法進入細胞。1.5 h后將病毒液吸去并以預冷PBS清洗3次以洗去殘余藥物，再加入2 mL不含魚腥草的MC覆蓋液。3 d后讀取細胞溶斑數。再將加藥物的試驗組與病毒控制組做比較。

1.11 病毒穿透試驗 將5×105個/mL的Vero細胞于37℃、5%CO2培養箱隔夜培養于6孔盤。第2天于試驗前先將6孔盤置于4℃預冷，1 h后吸去培養液，每孔加入力價含 100 PFU/100 μL HSV-1病毒，在4℃下吸附2 h，之后吸去病毒液，每孔加入1 mL含有魚腥草的培養液，37℃培養15 min，以允許病毒穿透細胞膜。之后吸去培養液，每孔加入1 mL酸性PBS（pH=3）作用1 min，將細胞外上外穿透細胞膜的病毒去活化，再以1 mL PBS潤洗細胞三次以中和酸堿性。之后每孔加入2 mL不含魚腥草的MC覆蓋液。3 d后讀取細胞溶斑數。再將加藥物試驗組與病毒控制組做比較。

1.12 藥物加入作用時間點試驗 將5×105個/mL的Vero細胞于37℃、5%CO2培養箱隔夜培養于6孔盤。第2天吸去培養液，每孔感染1 MOI的病毒。在37℃下感染1 h后吸去病毒液，再以2 mL PBS潤洗細胞三次。0 h組加入2 mL含有1 mg/mL魚腥草的培養液，其余組則加入不含魚腥草的培養液。分別在感染后的不同時間點吸去細胞上清液，以2 mL PBS潤洗細胞，加入2 mL含有1 mg/mL的魚腥草培養液。24 h后，將細胞上清液移去，以PBS潤洗細胞，利用胰島素將細胞打下，懸浮于1 mL培養液。在-80℃下冰凍解凍三次。以5000 r/min離心10 min，將上清液保存在-80℃。利用溶斑試驗定量不同時間點加藥的病毒量。

1.13 病毒RNA萃取 將Vero細胞以5×105個/mL種于6孔盤，待隔日細胞長滿后以1 MOI的病毒感染細胞。病毒吸附1 h后將病毒液吸起，并補入含1 mg/mL魚腥草的維持培養液1 mL，病毒控制組則補入維持培養液。置于37℃培養箱培養，分別在之后的第2、10、24 h以trypsin將各組細胞打下收于1.5 mL微量離心管，以2500 r/min離心10 min后將trypsin移除并以200 μL維持培養液將細胞混勻，暫時于4℃保存。之后將細胞離心并移去維持培養液，加入1 mL TRIzol試劑混合均勻后置于室溫5 min，然后加入0.2 mL氯仿并劇烈混合15 s后靜置于室溫3 min，再以12000 r/min于4℃離心15 min。將上層含RNA的水溶液移至新的1.5 mL微量離心管并加入0.5 mL異丙醇混合均勻后靜置于室溫10 min，以12000 r/min于4℃離心10 min后去除上清液。以1 mL 75%酒精清洗沉淀于管底的RNA，再以7500 r/min于4℃離心5 min后小心的移去酒精，并利用真空抽干5 min將RNA干燥，再以20 μL DEPC水（去除RNase的二次水）回溶RNA。為去除DNA的干擾，RNA中可再加入5 μL DNase I、3 μL 10×DNase緩沖液再補DEPC水至體積30 μL，置于37℃水浴槽作用20 min后，再加入50 mmol/L EDTA 3.5 μL于75℃水浴槽作用10 min后可將RNA保存于-80℃。

1.14 蛋白痕跡（Western blot）試驗 取出轉漬蛋白完成的 PVDF膜放到干凈的盒子中，加入10.0 mL緩沖液，于室溫中反應2 h以上。待遮蔽作用完成后，以PBST清洗PVDF膜三次，每次5 min，接著加入10.0 mL以5%脫脂奶粉稀釋后的一級抗體，在室溫中反應2 h，再以PBST清洗三次，再加入10.0 mL以5%脫脂奶粉稀釋后的二級抗體，在室溫中反應2 h，最后再以PBST清洗二次、PBS清洗一次之后呈色。

2 結果

2.1 中草藥的細胞毒性試驗 測試經處理后魚腥草粗萃取液對細胞的毒性，將藥液連續兩倍稀釋，加在預先培養好的細胞上，以MTT試驗來測試。圖1測試結果顯示，即使使用最高濃度（50 mg/mL），細胞仍然可以維持50%以上的活性，表明本中草藥安全低毒。

圖1 MTT試驗測試魚腥草對Vero細胞毒性

2.2 魚腥草抑制病毒試驗 先將大量培養的單純皰疹病毒連續10倍稀釋，以溶斑試驗測定病毒濃度，再將含有100 PFU的病毒液在37℃下感染Vero細胞1 h。洗去病毒液后，加入含有不同魚腥草粗萃取液濃度的1%MC。3 d后讀取細胞溶斑數。圖2測試結果顯示，魚腥草抑制HSV-1、HSV-2以及AR-HSV-1的50%感染力的藥液濃度（EC50）分別為0.692l、0.3、1.11 mg/mL。

圖2 溶斑減少試驗測試魚腥草抑制HSV-1、HSV-2以及ACV-HSV-1的作用

2.3 魚腥草抑制HSV-1及HSV-2的機制 圖3結果顯示，低于IC50濃度的魚腥草在室溫下和病毒作用3 h后，就可以完全抑制細胞產生溶斑，而將細胞先和魚腥草在37℃下作用則無法抑制病毒感染細胞。此結果顯示魚腥草可能直接和病毒顆粒作用而抑制病毒進入細胞。在HSV-1以及HSV-2皆可以觀察到相同的結果。為了進一步了解在病毒和魚腥草作用3 h后，病毒是否已死亡，將105PFU的病毒和不同濃度魚腥草作用 3 h后，將病毒稀釋1000倍以降低魚腥草的作用，將稀釋后的病毒感染細胞，此含有100 PFU的病毒在37℃感染細胞1 h后，以PBS洗細胞3次，加入MC覆蓋液。3 d后判讀細胞溶斑數。結果顯示，和最高濃度0.1 mg/mL魚腥草作用3 h后的病毒，其病毒顆粒仍然具有感染力，顯示魚腥草和病毒作用并不會直接殺死病毒（圖4）。

圖3 細胞和病毒預處理試驗探討魚腥草抑制HSV-1和HSV-2的機制

圖4 溶斑試驗測試魚腥草和病毒作用是否會殺死病毒

2.4 Western blot法試驗檢測魚腥草抑制病毒吸附細胞試驗 將病毒感染預冷的Vero細胞同時給與不同濃度的魚腥草，待病毒吸附1.5 h后，用預冷的PBS將病毒洗去。之后將細胞刮下，以抗病毒的醇蛋白D（anti-gD）的抗體偵測魚腥草是否可以抑制病毒貼附在細胞上。

圖5顯示，隨著魚腥草濃度增加，病毒貼附到細胞上的量會越來越少，顯示魚腥草的確可以抑制病毒貼附在細胞上。

圖5 Western blot發檢測魚腥草抑制病毒貼附細胞試驗

2.5 魚腥草抑制HSV吸附細胞以及穿透細胞試驗 根據藥物作用時間點的結果，魚腥草應該在病毒感染細胞的前期抑制了HSV感染Vero細胞。因此進一步探討魚腥草抑制病毒進入的機制。將病毒感染預冷的Vero細胞給予不同濃度魚腥草，待病毒吸附1.5 h后，用預冷的PBS將病毒洗去，并加入不含魚腥草的培養液。結果顯示加魚腥草的試驗組有效抑制CPE生成（P＜0.05）。而在魚腥草抑制HSV穿透細胞試驗方面，利用病毒于4℃下只能吸附在細胞表面，無法穿透細胞的特性，先將病毒液與細胞于4℃作用一段時間，之后再加入藥物并將已被病毒吸附的細胞于37℃培養。結果顯示魚腥草同時也可以抑制病毒穿透細胞（圖6）。

圖6 魚腥草抑制HSV吸附細胞及穿透細胞試驗

已知阿昔洛韋不會抑制細胞吸附，做為試驗控制組。

2.6 檢測核內VP16蛋白質及質內ICP4蛋白質表現 分別在病毒吸附以及穿透細胞時加入魚腥草，收集細胞，萃取細胞核蛋白質以及細胞質蛋白質，分別以Western blot法偵測病毒VP16以及ICP4蛋白質表達，藉此確認魚腥草是否會抑制病毒吸附以及穿透細胞。圖7顯示，隨著魚腥草濃度增加，病毒VP16蛋白質以及ICP4蛋白質表達量可看到被抑制的現象。顯示魚腥草確實可以抑制病毒吸附以及穿透細胞。

圖7 通過細胞核內VP16以及細胞質內ICP4的表達觀察魚腥草抑制病毒貼附及穿透細胞效果

2.7 魚腥草抑制病毒糖蛋白 D吸附細胞試驗HSV的糖蛋白D可以和宿主細胞表面蛋白質結合而調控病毒進入細胞內，是病毒進入細胞很重要蛋白質。為了了解魚腥草是否會經由結合病毒糖蛋白D而抑制病毒進入細胞，因此利用桿狀病毒系統表現HSV-2的糖蛋白D。將10-5μg/cell的重組糖蛋白D加入Vero細胞內，在37℃下作用1 h，以PBS潤洗細胞3次，之后將細胞刮下，以Western blot法偵測魚腥草是否可以抑制糖蛋白D結合到細胞上。圖8結果顯示，隨著魚腥草濃度增加，抑制糖蛋白D結合到細胞上的作用就更加明顯。

圖8 魚腥草抑制病毒糖蛋白D貼附細胞試驗

由此試驗推斷魚腥草可能是經由結合病毒糖蛋白D而抑制病毒進入細胞內。另外為了證明魚腥草是否抑制gD蛋白質結合到細胞上而并非抑制gD蛋白質表達，將gD蛋白質與不同濃度魚腥草在37℃下作用1 h，利用Western blot法分析gD蛋白質的量（圖9），推測魚腥草并不會改變糖蛋白D蛋白質的量。

圖9 以Western blot法分析魚腥草是否會抑制糖蛋白D表達

2.8 藥物作用時間點試驗 為了更進一步了解魚腥草抑制病毒的機制，利用藥物作用時間點試驗探討魚腥草抑制HSV的時間點。以1 MOI的HSV-1感染細胞1 h，在感染后的不同時間點加入1 mg/mL的魚腥草，于24 h后將細胞上清液移去，再以胰蛋白酶將細胞打下，懸浮于培養液后，冰凍解凍三次將病毒釋放出，最后利用溶斑試驗定量病毒。

圖10顯示，在經過感染12 h后加魚腥草，仍然可以抑制98%以上的病毒量，因此推測魚腥草除了可以抑制病毒進入細胞外，也有可能可以抑制病毒在細胞內的復制。

圖10 測試魚腥草抑制HSV-1感染的作用時間點試驗

2.9 免疫熒光法檢測魚腥草抑制病毒蛋白質合成 目前推測魚腥草除了可以抑制病毒進入細胞外，可能也可以抑制病毒在細胞內的復制。為了了解魚腥草是抑制病毒復制的哪一步驟，將分別根據病毒蛋白質合成以及不同時期基因表現來探討。首先研究魚腥草是否會抑制病毒蛋白質合成。以1 MOI的HSV感染細胞1 h，等病毒進入細胞后以PBS潤洗除去末進入細胞內的病毒，之后加入1 mg/mL的魚腥草，24 h后將細胞收下，點在玻片上，待細胞風干固定后，以抗HSV （anti-HSV）的抗體偵測病毒蛋白質表達。結果顯示加入魚腥草后，病毒的熒光量減少很多（圖11）。可見魚腥草可以有效抑制病毒蛋白質的合成。

圖11 利用熒光試驗檢測魚腥草是否抑制HSV蛋白質合成

2.10 魚腥草對人類細胞株毒性以及其抑制HSV-1感染人類細胞株的活性 先前所有的試驗都是在猴腎細胞株Vero上所進行，為了了解魚腥草對人類細胞是否具有毒性，因此選用了A549細胞（人類肺癌細胞）及HEp-2細胞（人類喉癌細胞）。首先以MTT試驗研究魚腥草對這兩株細胞的毒性。將魚腥草連續兩倍稀釋，加在預先培養好的細胞上，以MTT試驗來測試。結果顯示，魚腥草對于A549以及HEp-2細胞的毒性作用和在Vero細胞上類似（P＞0.05），與細胞對照組比較，即使使用最高濃度（50 mg/mL），細胞仍然可以維持50%以上的活性（P＞0.05）（圖12）。

圖12 以病毒前處理試驗分析B以及E抑制HSV試驗

2.11 以溶斑減少試驗分析不同分子量魚腥草抗HSV活性分析 為了進一步探討在魚腥草中具有抗HSV活性的成分，使用QuixStand系統進一步將魚腥草初萃取物依據分子量分成1000 Da以下、1000～3000 Da、3000 Da以上三個部分。利用溶斑減少試驗進一步分析此三種不同分子量的魚腥草抗HSV活性。結果顯示此三個部分皆具有抗病毒成分，但其中以1000 Da以下的部分抑制效果最好 （P＜0.01）（EC50=0.069 mg/mL）。而 1000～3000 Da以及 3000 Da以上的 EC50則分別為0.183、0.564 mg/mL。此部分魚腥草抑制單純皰疹病毒濃度結果總結于表1中。

表1 魚腥草粗萃取液抑制單純皰疹病毒劑量

2.12 以溶斑減少試驗分析不同魚腥草成分抗HSV活性分析 根據目前文獻指出，魚腥草內所含成分中大部分的物質分子量都在1000 Da以下，因此接下來將進一步分析這些分子中的抗HSV活性以及其機制。本試驗選定了六種成分進行分析。首先利用溶斑減少試驗分析此六種不同分子的抗HSV活性。根據顯示，在這六種分子中，B、E以及F具有抗HSV-1以及HSV-2的活性（P＜0.05）（表2）。

2.13 以病毒前處理試驗以及Western blot法分析不同魚腥草成分抑制HSV吸附細胞 之前結果顯示魚腥草可以經由直接和病毒顆粒作用而抑制病毒進入細胞。接下來將進一步分析在魚腥草內是何種成分抑制病毒進入細胞。首先利用病毒前處理試驗分析三種確定具有抗HSV活性的魚腥草成分是否可以抑制病毒進入細胞。將不同濃度的化合物分別和病毒以及細胞在室溫以及37℃下作用3 h，以100 PFU的病毒在37℃感染細胞1 h后，以PBS洗細胞3次，加入MC覆蓋液。3 d后判讀細胞溶斑數。

表2 不同魚腥草成分抑制單純皰疹病毒劑量

圖13 MTT試驗測試魚腥草對HEp-2以及A549細胞的毒性

圖13顯示，B、E、F三種具有抗HSV活性的物質中只有B可以直接和病毒作用而抑制病毒進入細胞內。利用Western blot法做進一步確認。將病毒感染預冷的Vero細胞給予不同濃度魚腥草，待病毒在4℃下吸附5 h后，以預冷的PBS將病毒洗去。之后將細胞刮下，以抗病毒糖蛋白D的抗體偵測魚腥草是否可以抑制病毒進入細胞內。隨著B濃度增加，抑制病毒結合到細胞上的作用就更加明顯（前后對比P＜0.05），而E則無法觀察到此現象（圖14）。顯示 B確實可以抑制病毒吸附在細胞上（前后對比P＞0.05）。

圖14 以Western blot法分析B以及E抑制HSV貼附細胞

2.14 以Western blot法分析不同魚腥草成分抑制HSV感染所引起的細胞NF-κB活化 魚腥草除了可以經由直接和病毒顆粒作用而抑制病毒進入細胞，在病毒進入細胞后，魚腥草也可以經由抑制細胞 NF-κB活化而減少 NF-κB結合至HSV的ICP0基因啟動子而抑制HSV復制。接下來分析在魚腥草內是何種成分抑制HSV感染所引起的細胞NF-κB活化。以1 MOI的HSV感染細胞1 h，等病毒進入細胞后以PBS洗去未進入細胞內的病毒，分別加入不同濃度的化合物，在感染后 3 h收集細胞，抽取細胞核蛋白質，以Western blot法檢測是否可以抑制NF-κB的活化。圖15顯示，B可以抑制NF-κB的活化，而E則無此明顯抑制現象。

圖15 Western blot法分析B以及E抑制HSV感染所引起的細胞NF-κB活化

3 討論與結論

研究結果顯示，魚腥草除了可抑制HSV-1，對于HSV-2以及Acyclovir resistant HSV-1（HSVAR）也具有很好的抑制效果。且魚腥草在高濃度時對細胞無毒性。將魚腥草初萃取物依據分子量分成 1000 Da以下、1000～3000 Da、3000 Da以上三部分，發現三部分皆具有抗病毒的成分，而其中又以1000 Da以下的部分抑制效果最好。因為利用QuixStand系統分離不同分子量物質時，無法完全將小分子量物質從大分子量中分離出來，故分子量3000 Da以上可能仍然含有部分的小分子量物質。因此分子量為 1000～3000 Da以及3000 Da以上的抗HSV活性有可能是因為分子量1000 Da以下殘留所導致。

而在魚腥草抑制病毒機制研究方面，結果顯示魚腥草可以抑制病毒感染的不同步驟。首先在病毒感染前，魚腥草直接和病毒的糖蛋白D結合而抑制病毒進入細胞內。除了糖蛋白D可以和宿主細胞表面蛋白質結合并調控病毒進入細胞之外，糖蛋白B也扮演了重要角色，在病毒進入細胞后，魚腥草也可以抑制因 HSV感染所引起的細胞NF-κB活化，進而減少NF-κB結合至 HSV的 ICP0基因啟動子而抑制HSV復制。本研究證實了魚腥草確實可以抑制因HSV感染所引起的細胞NF-κB活化，減少NF-κB結合至HSV的ICP0基因啟動子而抑制HSV復制。

目前分析六種魚腥草成分作用發現其中三種化合物B、E以及F具有抗HSV活性。其中B已被報道具有抗HSV的功效，然而其抑制HSV的機制尚未被證明。而E尚未有文獻指出具有抗HSV的活性。本研究指出B可以抑制病毒進入細胞以及NF-κB活化，F與E抑制HSV的機制目前則尚未了解。B已知為抗氧化物質，目前有研究指出B可以抑制NF-κB活化而有抗氧化的功能。另外在HSV感染時也會促使NF-κB活化而增加細胞內氧化壓力，且HSV的ICP27也可增加細胞內活性氧（reactive oxygen speces）以促使細胞凋亡。而B的抗氧化特性和抗病毒活性之間是否具有關聯則需進一步試驗證實。

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In vitro experimental was used to study cordate Houttuynia whether has inhibitory effect on type 2 herpes simplex virus infection，and further explore its inhibition mechanism and utility of herpes simplex virus.The results showed that using dissolve freckle reduction experiment found that its original extract can inhibit the following three kinds of viruses: less than 1000 Da，1000～3000 Da，more than 3000 Da.Among them，less than 1000 Da can show the best effect.Through analysis of six kinds of cordate Houttuynia，it’s found that B，E and F had anti HSV activity，B can suppress the virus into the cell.Cordate Houttuynia can suppress the virus and virus particles directly into the cell.After the virus into cell，cordate houttuynia by inhibiting NF-KB cell to reduce NF-KB combine，then HSVICPO gene start and inhibit the replication of HSV.

herpes simplex virus；Houttuynia；antiviral effect

S816.3

A

1004-3314（2017）10-0010-07

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171003