青貯用產纖維素酶菌株3X-10的產芽孢條件優化

郭 威，郭曉軍，武紅敏，2，董麗華，朱寶成

（1.河北農業大學生命科學學院，河北保定 071000；2.河北眾邦生物技術有限公司，河北保定 071000）

青貯用產纖維素酶菌株3X-10的產芽孢條件優化

郭 威1，郭曉軍1，武紅敏1，2，董麗華1，朱寶成1

（1.河北農業大學生命科學學院，河北保定 071000；2.河北眾邦生物技術有限公司，河北保定 071000）

本試驗旨在通過將單因素、Plackett-Burman（PB）篩選與響應面分析3種方法相結合來優化產纖維素酶菌株3X-10產芽孢發酵條件。以單因素試驗為基礎，PB試驗確定了影響菌株芽孢產量的主要因素，最后通過響應面法確定當發酵時間為67 h、接種量為7.00%、裝液量為61 mL/250 mL時菌株的芽孢產量達到最大，為3.22×109cfu/mL，較優化前的8.07×108cfu/mL增加了2.99倍。

纖維素酶；芽孢桿菌；條件優化

青貯飼料就是在新鮮飼草中加入青貯劑進行厭氧發酵得到的飼料。青貯飼料添加劑可以通過調節青貯料內微生物區系，調控青貯發酵進程，促進乳酸菌繁殖，將粗纖維與多糖分解，從而改善青貯飼料品質（趙士萍，2016）。乳酸菌類添加劑在生物青貯劑中應用最多，但由于乳酸菌添加劑不易保存，且不能降解纖維素，限制了其應用。纖維素酶產生菌通過產生纖維素酶，降解飼料中難以利用的纖維素為單糖或雙糖等可溶性糖，為乳酸菌、酵母菌的發酵提供更多的糖分，從而有助于其在青貯中發揮自身有益作用，促進青貯發酵。

芽孢具有較強的抗逆性，對其在不良環境中的存活具有重要作用，也有利于將芽孢桿菌加工成微生物菌劑。生長環境、營養物質等因素能夠影響芽孢的形成，但芽孢的形成并不是芽孢桿菌生活史必要的環節（張冬冬，2014）。所以產芽孢發酵條件的優化對于芽孢桿菌菌劑的產業化十分必要（孔少元，2016）。本試驗通過單因素試驗與響應面試驗結合對產纖維素酶株菌B.methylotrophicus 3X-10進行產芽孢條件優化，以期為中試生產工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 B.methylotrophicus 3X-10，由大熊貓糞便中篩選得到。

1.2 培養基 種子培養基：蛋白胨1.0%、葡萄糖1.0%、NaH2PO4·H2O 0.03%、MnSO4·H2O 0.02%、Na2HPO40.06%，pH值7.2～7.4。

發酵培養基：葡萄糖2.0%、蛋白胨1.0%、NaH2PO4·H2O 0.03%、Na2HPO40.06%、MnSO4·H2O 0.02%，pH值7.2～7.4。

牛肉膏蛋白胨培養基參照微生物學實驗（1999）配制。

1.3 種子液培養 活化菌株3X-10，將菌株接種于50 mL/250 mL種子培養基，于180 r/min、37℃搖床培養12 h后作為種子液。

1.4 發酵液培養 按6.0%接種量，將種子液接種到50 mL/250 mL發酵培養基，在180 r/min、37℃條件下搖床培養48 h，測定芽孢產量。

1.5 單因素試驗 以芽孢產量為測定指標，采用單因素試驗確定發酵培養基中最佳的碳源、氮源和無機鹽。

1.6 發酵培養條件優化試驗設計

1.6.1 Plackett-Burman試驗 在單因素試驗的基礎上，以芽孢產量為測定指標，通過 Plackett-Burman試驗設計，篩選對芽孢產量影響較大的因素。對影響產芽孢的碳源、氮源、無機鹽、接種量、搖床轉速、裝液量、培養溫度、初始pH值、培養時間9個影響因素進行篩選，另設2個虛擬列，以考察試驗誤差，共12組試驗。Plackett-Burman試驗因素和水平設置及設計方案分別見表1和表2。

表1 Plackett-Burman試驗因素及水平設置

1.6.2 最陡爬坡試驗 最陡爬坡試驗的起點設置在Plackett-Burman試驗的較低水平，步長和上升路徑根據Plackett-Burman試驗得到的3個主效應因素的比例關系設定，最終確定最陡爬坡試驗設計各因子的濃度范圍。

表2 Plackett-Burman試驗設計方案

1.6.3 響應面分析試驗 菌株的產芽孢發酵條件采用響應面分析法中的Box-Behnken試驗進行優化設計，根據試驗數據擬合得到二階響應面模型，得到最優試驗條件，并進行驗證（彭靜珊等，2015）。利用Design-Expert 8.0統計分析軟件處理和分析Plackett-Burman和Box-Behnken試驗的設計結果（徐向宏和何明珠，2010）。

1.6.4 芽孢產量測定方法

芽孢產量=生物量×芽孢形成率；

生物量測定采用細菌計數板計數。芽孢形成率測定采用芽孢染色法（沈萍，1999）。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 碳源對菌株芽孢產量的影響 如圖1所示，當碳源為玉米粉時，菌株3X-10的芽孢產量達到最高值，為1.70×109cfu/mL。因此，選取玉米粉為菌株3X-10的最佳碳源。

圖1 碳源對菌株3X-10芽孢產量的影響

2.1.2 氮源對菌株芽孢產量的影響 氮源對菌株芽孢產量的影響見圖2，當氮源為黃豆餅粉時，菌株3X-10的芽孢產量達到最高值，為1.52×109cfu/mL。因此，菌株3X-10的最適氮源選取黃豆餅粉。

圖2 氮源對菌株芽孢產量的影響

2.1.3 無機鹽對菌株芽孢產量的影響 從圖3可以看出，當無機鹽選MgSO4·7H2O時，菌株芽孢產量達到1.61×109cfu/mL，同比其他無機鹽種類芽孢產量最大，故菌株3X-10的最適無機鹽被確定為MgSO4·7H2O。

圖3 無機鹽對菌株芽孢產量的影響

2.2 發酵培養條件優化試驗設計

2.2.1 Plackett-Burman試驗結果 以芽孢產量為測定指標，對影響菌株培養基的重要因素進行篩選（徐向宏和何明珠，2010），菌株芽孢產量測定結果見表3，通過回歸分析，對于菌株3X-10進行試驗獲得多元一次回歸方程Y=12.82-0.46A-1.61B+0.52C+2.08E+5.65F-0.91G-2.33J+ 0.76K-1.10L，式中Y為芽孢產量預測值，A-L代表各因素編碼水平。Plackett-Burman試驗各因素參數主效應分析見表4，3X-10回歸模型的P值為0.0152（P＜0.05），由此說明株菌的模型在進行試驗的全部回歸區域內具有較好的擬合性。同時得出菌株 3X-10的發酵時間 （P= 0.0221）、裝液量（P=0.0148）、接種量（P=0.0185）是主要影響因素，為后續爬坡路徑試驗以及響應面分析試驗提供依據。

2.2.2 最陡爬坡試驗 只有在臨近最佳值的區域內，響應面擬合得出的方程才能最接近實際情況，因此有效的響應面擬合方程必須建立在最佳值區域內（賀強禮等，2016）。利用最陡爬坡試驗測定影響菌株芽孢產量的3個主要因素的中心點。由表5可知，芽孢產量在發酵時間為60 h、裝液量為60 mL/250 mL、接種量為5.6%時達到最大值，因此以此作為Box-Behnken試驗的中心點。

表3 Plackett-Burman試驗結果

表4 Plackett-Burman試驗各因素參數分析（菌株3X-10）

表5 最陡爬坡試驗結果

2.2.3 響應面分析結果 響應面分析法是一種尋找多因子系統中最佳條件的數學統計方法，其中Box-Behnken和Central Composite中心組合設計是兩種主要的響應面分析法 （RSA）（Ghatnur，2015）。本研究采用 Box-Behnken試驗設計法（Ghatnur，2015；Ji等，2015）進行響應面分析，Box-Benhnken具體因子水平和編碼值見表6，結果見表7。

表6 Box-Benhnken設計各因子及其編碼值

表7 Box-Behnken響應面優化試驗結果

運用Design Expert 8.06軟件對17個試驗點的響應面值進行回歸分析，結果見表8，獲得芽孢產量對三主因素的二次多項式回歸方程為：Y= 31.96+1.20A+1.44B+0.044C-0.58AB-0.055AC+ 0.67BC-2.26A2-5.56B2-3.73C2，式中 Y為菌株3X-10芽孢產量的預測值，A為接種量，B為發酵時間，C為裝樣量。

模型回歸P值為＜0.0001（P＜0.01），失擬項P值為0.0686＞0.05，說明回歸方程的顯著性和可靠性較高；因此模型可以用于菌株3X-10芽孢產量發酵優化的理論分析和預測。另外，二次響應面回歸模型的R2值為0.9876，說明回歸方程的擬合度較高，可用于芽孢產量的理論預測。

表8 3X-10菌株芽孢產量響應面試驗的方差分析

通過上述擬合回歸方程，通過Design Expert 8.06軟件分析得到相應的響應面分析圖和相應的等高圖，即所選取的3個因素中各因素的交互作用見圖4～圖6。每個響應面分別代表2個獨立變量之間的相互作用，此時第3個變量保持在0水平。等高線圖越接近橢圓，說明這兩個因素之間的交互作用越顯著，反之，若等高線圖接近圓形則說明這兩個因素之間的交互作用不顯著（陳濤等，2014）。

圖4 接種量和發酵時間對3X-10菌株芽孢產量交互影響的三維曲面圖和相應等高線圖（裝樣量=0）

圖5 接種量和裝樣量對3X-10菌株芽孢產量交互影響的三維曲面圖和相應等高線圖（發酵時間=0）

圖6 發酵時間和裝樣量對3X-10菌株芽孢產量交互影響的三維曲面圖和相應等高線圖（接種量=0）

由此可知，發酵時間和裝樣量之間的交互作用最顯著，圖6的響應面立體顯示的曲面頂點即為預測的菌株3X-10芽孢產量最大值，為32.20× 108cfu/mL，此時接種量為7.00%，發酵時間為67.20 h，取67 h，裝樣量為61.20 mL/250 mL，取61 mL/250 mL。對模型得出的產芽孢量最大值水平，進行6批次發酵試驗驗證，發酵產芽孢數平均值分別為（31.80±0.13）×108cfu/mL、（25.20±0.08）× 108cfu/mL、（32.22±0.20）×108cfu/mL，試驗值與預測值相差甚微，它們之間較好的吻合性顯示了各模型的精確性與可靠性。

3 討論

與正交設計試驗相比，響應面法優化菌株的產芽孢發酵條件，可以縮短試驗用時，并且可以篩選理論上的最佳發酵條件（Chen等，2005）。此法可以在較短周期內利用較少的試驗次數高精準地建立連續變量的曲面模型；還能對各影響因子水平及相互間的交互作用進行優化和評價（代志凱，2010）。王西祥等（2015）優化了枯草芽孢桿菌NS178的產芽孢發酵工藝，優化后菌落數和芽孢產率分別達到 34.50×108cfu/mL和 75.8%。Ben Khedher等使用響應面法對蘇云金桿菌的發酵條件進行了優化（Ben Khedher等，2011）。印楊（2013）和劉清術 （2013）分別對巨大芽孢桿菌RB10和1013進行了發酵產芽孢優化，均獲得顯著效果，菌株1013的芽孢產量比基礎培養提高了3.35倍。Luisa等（2015）利用響應面法對枯草芽孢桿菌菌株EA-CB0575產芽孢的培養基成分和培養基條件進行了優化，優化后芽孢產量達到8.78×109cfu/mL，相比優化前增加了17.2倍，較Plackett-Burman試驗增加了1.9倍。

4 結論

本研究通過對菌株3X-10產芽孢發酵條件進行優化，確定當發酵時間為67 h，接種量為7%，裝液量為61 mL/250 mL時菌株的芽孢產量最大，優化后菌株3X-10的芽孢產量比優化前增加2.99倍，效果顯著。

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This study was conducted to optimize the spore production fermentation conditions of strain 3X-10 producing Cellulase using the methods of single factor and Plackett-Burman（PB）combining with response surface methodology.On the basis of single factor，PB was used to screen and determine the main influential factors，and spore producing conditions were optimized by response surface analysis.Finally，fermentation time 67 h，inoculum density 7.00%and loading volum 61 mL/250 mL were determined as the optimum fermentation conditions.After optimizing，spore yield of 3X-10 increased by 2.99 times（from 8.07×108cfu/mL to 3.22×109cfu/mL）.

Cellulase；Bacillus；optimization

S816.3

A

1004-3314（2017）10-0023-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171006

河北省重點研發計劃農業關鍵共性技術攻關專項（16226604D）；河北省技術創新引導計劃科技型中小企業技術創新資金專項（15C1303121015）；保定市科學技術研究與發展計劃項目（16ZN007）；滄州市科技支撐計劃項目（161201007D）