海藻糖對乳酸桿菌耐熱和室溫貯存保護作用的研究

王 芳，康 超，林 靜，楊 玲，倪學勤，曾 東

（1.貴州省生物研究所，貴州貴陽550009；2.四川農業大學動物醫學院動物微生態工程研究中心，四川成都611130）

海藻糖對乳酸桿菌耐熱和室溫貯存保護作用的研究

王 芳1，康 超1，林 靜1，楊 玲1，倪學勤2，曾 東2

（1.貴州省生物研究所，貴州貴陽550009；2.四川農業大學動物醫學院動物微生態工程研究中心，四川成都611130）

乳酸桿菌不耐高溫和室溫貯存是其應用于飼料添加劑的一大限制因素，本試驗旨在研究5%（W/V）的海藻糖對三株乳酸桿菌在高溫處理和室溫貯存條件下的保護作用。結果表明：海藻糖能顯著提高乳酸桿菌耐熱性和室溫貯存的存活率，且不同菌株抗逆性能不同，其中F22菌株表現出較G31和H51兩株菌更好的耐熱性和耐貯性。添加海藻糖保護的F22菌株70℃處理5 min，活菌數為（6.0±0.1）×105cfu/mL，對照組為（1.2±0.1）×102cfu/mL；室溫貯存15 d，添加海藻糖的試驗組存活率為（127.94±0.23）%，對照組為（89.45±0.78）%。由此可見，海藻糖可作為微生態制劑高溫加工和室溫貯存的保護劑，提高乳酸桿菌的耐熱性和延長保質期。

微生態制劑；乳酸桿菌；海藻糖；存活率

微生態制劑是含活菌同時也含死菌及其代謝產物的有益微生物制品。飼喂微生態制劑可以改善動物腸道微生物菌群，提高飼料轉化率，增強動物機體免疫力，達到防病治病提高生產性能的目的。微生態制劑是抗生素的有效替代品，在飼料中添加微生態制劑是解決動物耐藥性的有效途徑之一。目前，國內外市場上的微生態制劑主要以乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌為主（張坤等，2014）。其中，乳酸菌屬是動物腸道中的有益微生物，主要有嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、糞鏈球菌等，該類制劑在生產、運輸、貯存過程中極易受高溫、高壓、氧化、干燥等不良環境的影響，導致制劑中活菌數減少，影響貨架期和功效穩定性（Liu等，2011）。因此，保持微生態制劑中益生菌活性至關重要。研究表明，在高溫、冷凍、干燥等惡劣環境下，海藻糖能在細胞表面形成獨特的保護膜，有效保護生物分子結構不被破壞，提高微生態制劑的活菌存活率，延長活菌制劑的貯存期（靳文斌等，2015；張云光等，2010；戴秀玉等，2001）。

本文研究了高溫處理和室溫貯存條件下，海藻糖對乳酸桿菌的保護作用，以期為微生態制劑的研究、生產提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 乳酸桿菌F22、G31、H51菌株，由四川農業大學動物微生態工程研究中心提供，其中F22和H51屬發酵乳桿菌，G31屬德氏乳桿菌德氏亞種（丁軻等，2004）。

1.1.2 藥品 海藻糖（含量＞98%）購于日本林原生物有限公司。

1.1.3 培養基 LBS培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸膏5 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL、K2HPO42 g、醋酸鈉5 g、枸櫞酸鈉2 g、MgSO4· 7H2O 200 mg、MnSO4·H2O 50 mg、瓊脂25 g、蒸餾水1000 mL，pH 6.0～6.5，115℃滅菌20 min。

1.1.4 主要儀器及器材 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），二氧化碳培養箱311（Thermo），數顯恒溫水浴鍋HH-6（金壇市富華儀器有限公司），高壓蒸汽滅菌鍋BXM-30R（上海博迅），移液器（Eppendorf），Tip頭、玻璃試管、移液管等均為國產。

1.2 方法

1.2.1 乳酸桿菌的培養 將乳酸桿菌F22、G31、H51分別接種于LBS液體培養基中，置于37℃恒溫箱中厭氧培養24 h。

1.2.2 海藻糖對乳酸桿菌耐熱保護性的測定 將培養24 h的乳酸桿菌F22、G31、H51菌液，分別分裝到不同試管中，每支試管10 mL。分別將裝有F22、G31、H51菌液的試管分為兩組，以加入5%的海藻糖為試驗組，以不加海藻糖為對照組。將裝有不同菌液的試管放入70℃的恒溫水浴鍋中分別處理3 min和5 min，測定乳酸桿菌初始活菌數（處理前活菌數）和高溫處理不同時間后的活菌數，并計算其存活率。

樣品稀釋：利用10倍遞增稀釋法將對照組和試驗組乳酸桿菌F22、G31、H51菌液分別稀釋108倍，取對照組 106、107、108稀釋度和試驗組 103、104、105、106、107、108稀釋度的菌液，用滴種計數法測定乳酸桿菌活菌數。

滴種計數法：將待測物稀釋到適當的倍數，用移液器取20 μL滴加于LBS固體培養基上，每個稀釋度做三個重復，37℃培養24 h計數。活菌數及存活率的計算公式為：

活菌數/（cfu/mL）=活菌數平均值×稀釋倍數×50；

1.2.3 海藻糖對乳酸桿菌常溫貯存保護性的測定將培養24 h的乳酸桿菌F22、G31、H51菌液，分別分裝到不同試管中，每支試管10 mL。分別將裝有F22、G31、H51菌液的試管分為兩組，以加入5%的海藻糖為試驗組，以不加海藻糖為對照組，在室溫避光條件下分別貯存1、3、5、10、15 d，測定乳酸桿菌初始活菌數（處理前活菌數）和貯存不同時間后的活菌數，并計算其存活率，測定及計算方法同1.2.2。

1.3 數據處理 試驗每個處理3個重復，結果用“平均值±標準差”表示。數據采用SPSS 19.0軟件進行處理。

2 結果

2.1 海藻糖對乳酸桿菌耐熱性的影響 海藻糖對乳酸桿菌耐熱性的影響見表1，三株乳酸桿菌F22、G31、H51經70℃處理后活菌數降低103～108倍，處理3 min和5 min差異極顯著，活菌存活率隨高溫處理時間延長顯著下降。添加海藻糖的試驗組活菌數與對照組差異極顯著，其中F22菌株70℃處理3 min試驗組活菌數是對照組的2.4倍，處理 5 min試驗組活菌數是對照組的1000倍；G31和H51菌株70℃處理3 min后試驗組活菌數比對照組分別提高105和104倍，處理5 min后仍有活菌，但對照組活菌數為0。表明添加海藻糖能夠顯著提高乳酸桿菌對高溫的耐受性；三個試驗菌株中F22活菌存活率最高，說明不同菌株對高溫耐受能力不同。

表1 海藻糖對乳酸桿菌耐熱性的影響

2.2 海藻糖對乳酸桿菌常溫貯存的影響 海藻糖對乳酸桿菌常溫貯存的影響如表2所示，F22菌株試驗組于貯存第1、5、10、15天出現4次增長高峰，活菌數顯著高于初始活菌數，而對照組活菌數僅于貯存第5天比初始活菌數高；試驗組和對照組活菌數均于貯存第3天出現顯著下降，但添加海藻糖的試驗組活菌數較對照組高1倍；貯存15 d，試驗組菌株存活率顯著高于對照組，分別為（127.94±0.23）%和（89.45±0.78）%。H51菌株貯存1 d后，試驗組活菌數比初始活菌數增加 3.0× 108cfu/mL，對照組活菌數下降2.0×108cfu/mL；貯存15 d，試驗組和對照組活菌數均下降3個數量級。G31菌株活菌數隨著貯存時間的延長逐漸下降，試驗組活菌數與對照組活菌數的變化無顯著差異；貯存15 d，試驗組活菌存活率顯著高于對照組，分別為（28.37±1.12）%和（9.01±0.35）%。經過15 d的貯存，三株乳酸桿菌活菌存活率從高到低順序為：F22試驗組＞F22對照組＞G31試驗組＞G31對照組＞H51對照組≈H51試驗組。乳酸桿菌室溫貯存添加海藻糖可顯著提高活菌存活率，不同菌株活菌存活率存在顯著差異，與菌株生物特性有關。

表2 海藻糖對乳酸桿菌常溫貯存的影響

3 討論

3.1 海藻糖對乳酸桿菌耐熱保護作用 本試驗結果表明，添加5%的海藻糖對乳酸桿菌有一定的耐熱保護作用，但對不同菌株的影響差異顯著，對F22菌株的耐熱保護性優于G31和H51，添加海藻糖保護的F22菌株70℃處理5 min活菌數比G31和H51高5個數量級；對照組比其余兩組高2個數量級，說明不同菌株耐熱性不同。李夢菲（2015）研究表明，高產β-半乳糖苷酶的耐熱乳酸菌其耐熱性與蛋白質一級和二級結構的改變有關。黃滄海（2004）報道，乳酸菌不耐熱，75℃處理15 min存活率為45.1%，70℃處理10 min之后基本沒有活菌。馮鎮（2008）報道，乳酸菌在高溫條件下，產生自溶，由于自溶酶在溫度較高時活性較強，加快了對乳酸菌細胞壁的水解，導致菌體細胞裂解；加之菌體蛋白在高溫時變性，從而導致活菌數下降。本試驗中添加5%海藻糖的F22菌株經過70℃處理5 min活菌數比對照組高3個數量級，說明添加海藻糖能提高乳酸桿菌的耐熱保護性。海藻糖具有降低膜相變溫度的作用，能夠保護干燥細胞的蛋白質結構，在高溫干燥過程中提高細胞存活率 （李瀅冰等，2000）。戴秀玉（2001）研究發現，海藻糖對干燥狀態下細胞的耐高溫保護效果更好，細胞存活率比溶液狀態高3～4個數量級。乳酸桿菌不耐高溫是其應用于飼料添加劑的一大限制因素，開展耐熱乳酸桿菌和保護劑的篩選尤為重要。

3.2 海藻糖對乳酸桿菌常溫貯存的影響 本試驗添加5%的海藻糖對不同乳酸桿菌菌株的保護性差異顯著，三株乳酸桿菌貯存15 d活菌存活率分別為：F22試驗組和對照組分別為 （127.94± 0.23）%和（89.45±0.78）%，G31試驗組和對照組分別為（28.37±1.12）%和（9.01±0.35）%，H51試驗組和對照組分別為 （0.0005±0.0001）%和 （0.0006± 0.0001）%。三株乳酸桿菌中添加海藻糖保護的F22菌株不但活菌數沒有下降，反而比初始活菌數提高27.94%，G31菌株活菌數顯著下降，但添加海藻糖的試驗組活菌數存活率比對照高約20%，H51菌株試驗組與對照組無顯著差異。海藻糖通過在菌體外部形成保護膜，保護生物膜和蛋白質等在不良環境中免受傷害，并且使菌體不受自身代謝產物的影響，從而提高乳酸桿菌室溫貯存的活菌數， 延長保質期 （Colaco等，1995；Wiemken等，1990）；不同乳酸桿菌菌株在室溫貯存過程中活力不同，與其生物特性有關。

4 結論

添加5%的海藻糖能夠顯著提高乳酸桿菌在高溫處理和室溫貯存條件下的存活率，其中F22菌株耐熱性和室溫貯存的存活率比G31和H51菌株更好。海藻糖可作為微生態制劑高溫加工和室溫貯存的保護劑，但要提高乳酸桿菌的耐熱性和延長其保質期，還應從選育抗逆性好的菌種著手。

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Lactobacillus is not resistant to high temperature and room temperature storage，which is one of the main limit factor to its application in feed additives.This study aimed to investigate the 5%（m/V）of trehalose on three Lactobacillus under the condition of high temperature and room temperature storage.The results showed that trehalose can significantly increase survival rates of Lactobacillus thermal stability and room temperature storage，and different strain resistance was different.F22 showed better heat resistance and storability than G31 and H51.F22 in the added trehalose group was put in the condition of 70℃deal with 5 min，the number of living bacterium was（6.0±0.1）×105cfu/mL，the control group was（1.2± 0.1）×102cfu/mL；Stored at room temperature for 15 days，survival rate of treatment group was （127.94±0.23）%，the control group was（89.45±0.78）%.It was concluded that the trehalose can be used as protectant in high-temperature processing and room temperature storage，which can improve the heat resistance of Lactobacillus and extend the shelf life.

microbial ecological agents；Lactobacillus；trehalose；survival rate

S816.79

A

1004-3314（2017）10-0017-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171004

貴州科學院2013年基金項目；貴州省科技廳農業攻關項目（黔科合NY[2015]3017-2號）；貴州省科學技術基金計劃項目（黔科合J字[2014]2115號）；貴州省科技廳重大專項（黔科合重大專項字[2013]6014）；貴州省科技支撐項目（黔科合支撐[2016]2600號）