基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass技術的山羊奶、大豆奶、牛奶的脂質組分析研究

周曉麗 譯

（北京屯玉種業有限責任公司，北京海淀 100193）

檢測分析

基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass技術的山羊奶、大豆奶、牛奶的脂質組分析研究

周曉麗 譯

（北京屯玉種業有限責任公司，北京海淀 100193）

乳制品是不同種類脂質的豐富來源，對人類健康至關重要。本研究基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass技術建立了不同類型乳制品 （包括山羊奶、大豆奶和牛奶）全面脂質組分析的方法。研究表明：共5種神經酰胺（Cer），9種鞘磷脂（SM），4種溶血磷脂酰膽堿（LPC），21種磷脂酰膽堿（PC），14種磷脂酰乙醇胺（PE），17種甘油二酯（DG），300種甘油三酯（TG），7種磷脂酸（PA），9種磷脂酰甘油（PG），20種磷脂酰肌醇（PI），14種磷脂酰絲氨酸（PS），4種溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）和38種脂肪酸（FA）被檢出，并且其種類和含量在不同類型乳制品中的分布差異顯著。其中，大豆奶中富含磷脂（包括PC、PE、PS、PG），而山羊奶中富含中鏈甘油三酯（MCT）、不飽和脂肪酸（USFA）、ω-6 FA和ω-3 FA（尤其是EPA和DHA）。此外，本研究基于脂質組分差異建立了PLS鑒別模型，并篩查出14類脂質標記物用來鑒別乳制品的類型，從而為乳制品真實性鑒別奠定基礎。

山羊奶；大豆奶；牛奶；UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass；脂質組

乳制品是不同種類脂質的豐富來源（Trenerry等，2013；Haug等，2007；German等，2006）。脂質具有諸多生物活性，通常被分為8大類 （Fahy等，2005）。甘油三酯（TG）是乳脂肪的主要成分，含量占乳脂肪的98.3%，在乳制品質地和風味中起重要作用（MacGibbon和Taylor，2006）。然而，攝入過多的TG會導致肥胖，高血壓等（Unger等，2001；Han等，2000）。乳制品中還含有豐富的脂肪酸。脂肪酸與人類健康直接相關，例如，高濃度的飽和脂肪酸（SFA）可誘導心血管疾病，而多不飽和脂肪酸（PUFA）可以減少心血管疾病的發生，并增強機體免疫力（Abedi等，2014；Mori，2006）。此外，乳制品中還含有一定量的功能活性脂，如磷脂。磷脂是生物膜的重要組成部分，并具有諸多功能活性，如抗炎活性，且磷脂與降低心血管疾病風險和機體對膽固醇的吸收有關（Küllenberg等，2012）。研究報道，不同種類的乳制品中脂質的種類與含量分布不同，從而導致不同種類的乳制品營養價值各異（Liu等，2015；Donato等，2011）。因此，乳制品的脂質成分分析對于評估乳制品的營養價值具有重要意義。此外，經脂質成分分析得到的乳制品的脂質種類與含量數據還可用于乳制品的真實性鑒別，從而為乳制品的質量安全提供保障。

為了實現乳制品的脂質成分分析，近年來，已開發了諸多方法，例如，氣相色譜串聯質譜法（GC-MS）（Fontecha等，2005；Fontecha等，2000），和液相色譜串聯質譜法 （LC-MS）（Gastaldi等，2011；Donato等，2011；Haddad等，2011；Kalo等，2004；Mottram和 Evershed，2001；Laakso和 Manninen，1997）。Trenerry等 （2013）還開發了一種UHPLC-ion trap-MS法來鑒別牛奶中的極性脂。Byrdwell等（2007）則開發了一種LC-APCI/ESIMS技術同時檢測牛奶中的鞘脂類成分。然而，仍缺少一種實現乳制品脂質組全面分析的方法。QExactive Orbitrap MS是近年來新開發出的一種具有高分辨率、靈敏度、準確度的技術，與普通質譜相比，它呈現出了一種碎片離子掃描分析鑒別各種脂質同分異構體的超強能力 （Senyuva等，2015）。目前，該技術已成功應用于牛奶和人奶的極性脂質組分差異識別鑒定上（Liu等，2015）。

本研究旨在建立一種基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass技術的山羊奶、大豆奶、牛奶的脂質成分分析方法。為獲得山羊奶、大豆奶、牛奶中更全面的脂質分布信息，篩查山羊奶、大豆奶、牛奶的差別表征因子提供技術支持，并為進一步的乳制品摻假識別奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試劑 標準品包括LPC，PC，PE，PS，PG從美國Avanti公司購買，Cer，DG，TG，FA和醋酸銨從美國Sigma公司購買。氯仿從北京普昔宜康公司購買，HPLC級乙腈（ACN）、異丙醇（IPA）、甲醇從美國Fisher公司購買，超純水來自于Milli-Q超純水系統。

1.2 樣品前處理 超高溫滅菌（UHT）山羊奶，大豆奶，牛奶各10個品牌，分不同批次，歷時5個月，奶樣采購于中國10個地區的超市，以確保樣品具有代表性。

奶樣提脂是依據Folch和Bligh的方法（Bligh和Dyer，1959；Folch等，1957）：取0.2 mL奶樣，加入1 mL超純水和3 mL氯仿甲醇提取液 （CHCl3∶MeOH=2∶1，v/v），室溫混勻10 min后于2000 r/min下離心15 min。取下層氯仿層后氮吹干燥，并重溶于400 μL CHCl3∶MeOH（2∶1，v/v），待測。樣品重復試驗3次。

1.3 儀器參數 采用Thermo Fisher公司的UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass儀器進行檢測，該儀器配備HESI探頭。分別選用Waters公司的CORTECS C18 100×2.1 mm 2.7 μm色譜柱和XSelect CSH C18 100×2.1 mm 2.5 μm色譜柱進行正、負離子模式檢測。流動相A相為ACN∶H2O（60∶40，v/v，含10 mM醋酸銨），B相為IPA：CAN（90∶10，v/v，含10 mM醋酸銨）。流速設置為250 μL/min。洗脫梯度為：0～20 min流動相B由37%升至98%，之后為98%的流動相B洗脫6 min，再利用37%的流動相B平衡4 min。柱溫箱和樣品盤溫度分別設置為45、10℃。

正負離子模式下的質譜數據采集范圍分別為240～2000 m/z和200～2000 m/z。全掃描和碎片掃描分辨率分別為70000和17500。噴霧電壓為3000 v，碰撞溫度為320℃，加熱器溫度為300℃，鞘氣流速為35 Arb，輔助氣流速為10 Arb。數據分析采用軟件Lipidsearch 4.0（Thermo Fisher，CA）。定性是基于碎片離子信息（MS2）來實現的。該方法中，MS1的誤差＜5 mg/L，MS2的誤差＜8 mg/L。并且分析過程中將m得分＜10和峰面積＜1e5的值剔除。正離子模式下將奶樣的脂質提取物稀釋20倍后進樣1 μL；由于負離子模式靈敏度不如正離子模式高，因此是將奶樣的脂質提取物稀釋2倍后進樣1 μL。

1.4 統計分析 峰面積計算采用軟件Xcalibur 3.2.63（Thermo Fisher，USA）。最小二乘法判別分析（PLS-DA）采用軟件SIMCA-P 11.5，方差分析（ANOVA）采用軟件SPSS 21.0。置信區間為95%（Brown等，2005）。

2 結果與討論

2.1 方法驗證和脂質分析 如圖1所示，為山羊奶、大豆奶、牛奶基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass技術分別在正離子模式和負離子模式下掃描得到的圖譜，表1顯示了山羊奶、大豆奶、牛奶的脂質定性信息。其中，共有5種神經酰胺（Cer），9種鞘磷脂 （SM），4種溶血磷脂酰膽堿（LPC），21種磷脂酰膽堿（PC），14種磷脂酰乙醇胺（PE），以及17種甘油二酯（DG）和300種甘油三酯（TG）由正離子模式掃描得到；共7種磷脂酸（PA），9種磷脂酰甘油（PG），20種磷脂酰肌醇（PI），14種磷脂酰絲氨酸 （PS），4種溶血磷脂酰乙醇胺 （LPE）和38種脂肪酸（FA）由負離子模式掃描得到。

圖1 利用UPLC-Q-Exactive orbitrap MS技術分別在正離子模式（a）和負離子模式（b）下的采集信息圖

經外標法定量，可獲得不同種類脂質的線性定量方程（如表2所示）。依據Donato（2011）等人的研究結果，將3倍信噪比定為檢出限，10倍信噪比定為定量限，其中檢出限均≤0.004 μg/mL，定量限均≤0.02 μg/mL。此外，將奶樣加標提取后定量獲得的脂質含量與標準溶液進行比較，可確定其回收率。將空白奶樣提取后進行加標處理定量獲得的脂質含量與標準溶液進行比較，可評價其基質效應。如表3所示，9類脂質的回收率為80.54%～110.07%，相對標準偏差小于10%，并且無顯著的基質干擾，由此可見，該方法具有較高的重復性和準確性。

2.2 不同乳制品間脂質組差異分析 經定量分析發現，不同種類的乳制品中脂質的種類與含量分布具有顯著性差異。其具有顯著性差異的脂質如下所述：在正離子模式下，檢測到大豆奶中含有PC（16∶0/22∶6，含量為0.03～0.12 μg/mL），PE（16∶1/20∶4，含量為0.05～0.17 μg/mL），DG（18∶3/18∶3，含量為0.08～0.2 μg/mL）；牛奶中含有Cer（16∶0/22∶0，含量為0.2～1.0 ng/mL），Cer（16∶1/22∶0，含量為2.5～3.5 ng/mL）和Cer（18∶0/22∶0，含量為23.4～27.6 ng/mL）。在負離子模式下，檢測到大豆奶中含有7種PA（16∶0/18∶2，16∶0/18∶3，18∶0/18∶2，18∶0/ 18∶2，18∶2/18∶2，18∶3/18∶2，18∶3/18∶3），9種PG（16∶0/ 16∶0，18∶0/16∶0，16∶0/18∶1，16∶0/18∶2，16∶0/18∶3，18∶0/ 18∶2，18∶1/18∶2，18∶2/18∶2，18∶3/18∶2，總含量為22.66～25.41 μg/mL），以及4種PI（15∶0/18∶2，18∶3/ 18∶2，22∶0/18∶2，16∶0/18∶3）；在牛奶中檢測到PA（18∶ 2/18∶2），2種PG（16∶0/18∶1，18∶0/18∶2，總含量為0.026～0.035 μg/mL）和2種PI（18∶0/23∶0，18∶1/20∶4）；在山羊奶中檢測到4種PG（16∶0/18∶1，16∶0/18∶2，18∶0/18∶2，18∶1/18∶2，總含量為0.54～0.66 μg/mL）和3種PI（16∶0/18∶3，18∶0/23∶0，18∶1/20∶4）。

表1 脂質定性信息表

（續表1）

經方差分析（ANOVA）得出（如圖2所示），大豆奶富含磷脂，其中PE，PG，PS，PC的含量高于山羊奶和牛奶（P＜0.05）。與大豆奶和山羊奶相比，牛奶中含有較高的Cer和DG（P＜0.01）。此外，TG和中鏈甘油三酯 （MCT）的含量在牛奶中最高 （P＜0.001）。然而，MCT和TG的比值較山羊奶低，其中牛奶中MCT/TG為39%，山羊奶中MCT/TG為46%。據MosheRubin等（2000）和℃tavio等（2000）的研究表明，MCT更容易被人體吸收。因此，對于肥胖人群而言，攝入山羊奶要比牛奶更適合。

表2 9類脂質的定量方程及線性范圍、檢出限、定量限

表3 9類脂質的基質效應和添加回收率

2.3 山羊奶、大豆奶和牛奶的脂肪酸定量分析如圖2所示，山羊奶、大豆奶、牛奶中單不飽和脂肪酸（MUFA），多不飽和脂肪酸（PUFA）和飽和脂肪酸（SFA）的含量差異顯著（P＜0.01）。其中，山羊奶中不飽和脂肪酸（USFA，i.e.MUFA+PUFA）的含量較大豆奶、牛奶較高（P＜0.001）。山羊奶、大豆奶、牛奶中SFA，MUFA和PUFA的含量之比分別為1∶0.7∶0.2，1∶0.8∶0.4和1∶0.6∶0.1。ω-6和ω-3型脂肪酸在不同種類乳制品中的含量差異顯著（P＜0.001），例如，LA含量在大豆奶中最高，山羊奶次之，牛奶最低；ARA的含量在山羊奶中最高，牛奶次之，大豆奶最低；ALA的含量在大豆奶中最高，山羊奶次之，牛奶最低；EPA和DHA的含量均在山羊奶中最高，牛奶次之，大豆奶最低。其中，山羊奶中EPA和DHA的含量分別為1.87～1.99 μg/mL和1.17～1.27 μg/mL。研究報道，EPA和DHA可以降低總膽固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯的水平，并增加免疫系統的活性 （Van Valenberg等，2013；Swanson等，2012；Abeywardena，2011；Moghadasian等，2008；Ruxton等，2007；Calder，2006）。

圖2 脂質含量在山羊奶、大豆奶、牛奶中的差異比較

2.4 PLS鑒別模型的建立 基于不同種類的乳制品中具有顯著性差異的脂質數據，進行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），可獲得不同種類乳制品的偏最小二乘法判別模型（如圖3a所示）。其中，前兩個主成分的方差累積貢獻率達86.9%，該模型可有效地進行不同種類乳制品的真實性鑒別。此外，方差貢獻值（VIP）的大小可用于評估具有顯著性差異的脂質對所建立的PLS-DA模型的貢獻率大小，從而篩選出可用于不同種類乳制品真實性鑒別的表征因子。如圖3b所示，總共14個變量（VIP＞1）被認為具有顯著貢獻，且這些脂質可用作山羊奶，大豆奶和牛奶真實性鑒別的表征因子。

圖3 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）得分圖（a）與方差貢獻因子柱形圖（b）

3 小結

本研究建立了一種基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術進行山羊奶、大豆奶、牛奶的脂質成分分析的方法。試驗中比較了山羊奶、大豆奶、牛奶的脂質種類與含量分布的顯著性差異，并利用具有顯著性差異的脂質進行PLS-DA模型建立，以進行山羊奶、大豆奶、牛奶的真實性鑒別，并篩選出方差貢獻值較高的14類脂質作為真實性鑒別的表征因子，為日后乳制品的質量安全提供技術支撐。

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（譯自：Food Chemistry，2017，224：302～309.）

Lipids are very important for human health and milk is a rich dietary source of lipids.In this study，the lipid content in three types of milk（goat，soy and bovine）were determined by using UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass Spectrometry.A total of 13 classes of lipids（including Cer，SM，LPC，PC，PE，DG，TG，PA，PG，PI，PS，LPE，FA）were measured.Moreover，lipid profiles differed significantly between the different milk types.Soymilk is rich in phospholipids including PC，PE，PS，PG，while goat milk is rich in medium chain triglycerides（MCT），USFA，ω-6 FA and ω-3 FA，especially EPA and DHA.Furthermore，a PLS model was established for differentiation of milk types based on the lipid profiles. A total of 14 lipids were identified as biomarkers for differentiation of milk types，thus providing a basis for milk authentication and detection of adulteration.

goat milk；soymilk；bovine milk；UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass；lipidomics

S816.17

A

1004-3314（2017）10-0033-06

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171008

國家自然科學基金（31371779）；國家國際科技合作專項（2015DFG31890）