仿生蜂巢花粉制備方法及其活性成分測定的研究

楊茂森 張世文 王鑫 劉占莉

（甘肅省蜂業技術推廣總站，天水741020）

仿生蜂巢花粉制備方法及其活性成分測定的研究

楊茂森 張世文 王鑫 劉占莉

（甘肅省蜂業技術推廣總站，天水741020）

蜂巢花粉是蜜蜂真正的天然食物，是蜜蜂采集植物花粉過程或在蜂房內摻入自身唾液與蜂蜜后釀造成熟的產品，蜜蜂及其幼蟲缺食蜂巢花粉，將造成群勢下降、幼蟲不能完全羽化。根據蜜蜂釀制花粉的原理，我們采用多級發酵技術，確立了仿生蜂巢花粉的制備方法；通過蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉（三種材料都是油菜花粉）對比研究試驗，發現仿生蜂巢花粉中的活性化學成分含量高于蜂花粉、蜂巢花粉的含量。通過對不同花粉淀粉酶、蛋白酶的對比檢測試驗，發現仿生蜂巢花粉中這兩種活性酶的含量與蜂巢花粉的含量十分接近。本研究為進一步開發活性仿生蜂巢花粉制劑及其單一活性物質產品提供了理論依據。

蜂花粉；蜂巢花粉；仿生蜂巢花粉；淀粉酶；蛋白酶

花粉為植物的雄性生殖細胞，它具有很高的營養價值和藥用價值。現代醫學研究證實：花粉具有預防腦心血管疾病、降血脂，調節神經系統，促進睡眠，調節胃腸系統功能，促進消化，治療習慣性便秘；在調節內分泌、提高機體免疫功能、抗衰老、改善性功能、治療男性不育、前列腺炎癥等方面有一定的效果，具有防癌抑癌、保肝護肝、防止貧血、糖尿病、抗疲勞、養顏美容等功能而倍受人們的關注和應用[1-6]。蜂花粉是經蜜蜂采集的花粉，在蜂箱巢門口人工脫取的花粉被稱為“蜂花粉”，經蜜蜂采集帶回巢內釀造成熟的花粉被稱為“蜂巢花粉”，蜂巢花粉是蜂花粉在巢脾蜂房內被蜜蜂加入自身唾液和蜂蜜后，得以釀熟的天然產品。蜂巢花粉是蜜蜂真正的食物，具有很高的營養和藥用價值。但是人類要享用蜂巢花粉，只能采取人工掏取的辦法，經我們試驗：一個勞力一天（8小時）的掏取量在350～450g左右，生產成本較高。如何批量生產出與天然蜂巢花粉活性成分接近的產品，是本研究要解決的問題。

我國是世界第一養蜂大國，蜂花粉產量及出口量均居世界首位。據2009年統計數據：我國蜂花粉年產量超過13500噸，產量位居世界第一，其中一部分用于保健食品或藥品，一部分用于出口外銷，絕大多數被用做蜜蜂過冬時的“口糧”。我國可開發利用的蜂花粉數量在600噸以上，如果采用仿生蜂巢花粉的制備方法，可增進吸收，使其附加值得以大幅提高，從而帶動提升國內養蜂業的經濟效益。我國仿生蜂巢花粉產品研發剛剛起步，其發展前景十分遠大[7]。

1 儀器與材料

紫外光譜儀：UV-2001型紫外光譜儀（日本日立公司）；Surveyor高效液相色譜分析儀（Thermo Finnigan）；凍干機；

油菜（Brassica campestris L）蜂花粉、天然蜂巢花粉均由甘肅耐克特蜂產品有限公司采集并通過蘭州大學藥學院馬志剛教授鑒定。

酵母菌：安琪酵母股份有限公司提供；乳酸菌：河南君安生物技術有限公司提供；蘆丁標準品：成都曼思特生物科技有限公司；葡萄糖標準品:成都曼思特生物科技有限公司；甲醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；亞硝酸鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；硝酸鋁：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；NaOH:分析純，國藥集團化學試劑有限公司；苯酚:分析純，國藥集團化學試劑有限公司；硫酸:分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

2 試驗方法與分析

2.1 仿生蜂巢花粉的制備方法

蜂花粉的稱量、滅菌：從冷庫稱取油菜蜂花粉，精選除雜，經臭氧殺菌機滅菌，使原料蜂花粉達到食品安全衛生要求。

脫敏處理：按蜂花粉重量的15～30%噴灑生理鹽水，攪拌均勻后，在溫度為28～38℃條件下培養48～72小時，完成第一級處理。

蜂巢花粉液處理：對完成第一級處理蜂花粉，按每份1 kg均勻噴灑200～300 ml蜂巢花粉培養液，在溫度為28～35℃條件下培養48～72小時，完成第二級處理。

天然蜂巢花粉液的準備方法：用蒸餾水制成5%濃度的滅菌蜂花粉液,用蜂蜜調節其糖度18%，然后加入天然蜂巢花粉，天然蜂巢花粉含量達12%（w/v）以上，調節pH值在3.5，在恒溫箱28～35℃條件下培養3天，得到天然蜂巢花粉液。

酵母菌液處理[8，9]：對完成第二級處理的蜂花粉，按每份1kg均勻噴灑200～300ml酵母菌液，在溫度為28～35℃條件下培養48～72小時，完成第三級處理。

酵母菌液的準備方法：用蒸餾水制成5%濃度的滅菌蜂花粉液,用蜂蜜調節其糖度在18%，調節pH值在3.5，在恒溫箱28～35℃條件下自然接種培養5天,得到酵母菌培養液。

乳酸菌液處理[9，10]：對完成第三級處理的蜂花粉，按每kg均勻噴灑200～300ml乳酸菌液，在溫度為28～35℃條件下培養48～72小時，完成第四級處理。

乳酸菌液的準備方法：用蒸餾水制成5%濃度的滅菌蜂花粉液，量取加入天水當地漿水菜汁，漿水菜汁含量為25%（v/v），在恒溫箱25～30℃條件下培養3天，得到乳酸菌培養液。

真空凍干：完成第四級處理的蜂花粉，用60目的紗網制成小顆粒后，進行真空凍干處理36～48小時，溫度控制在-55～-65℃之間，真空度為-0.009MPa，使花粉中含水量在3～5%即可。

滅菌：將完成凍干的蜂花粉置于臭氧滅菌罐中滅菌，滅菌時間為50分鐘，完成滅菌后裝入潔凈食品袋中備用,即生產出凍干活性仿生蜂巢花粉。

2.2 油菜蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分對比檢測

油菜蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分對比采用高效液相色譜測定[11]，其色譜條件為色譜柱：Hypersil GOLD C18 2.1×150mm；柱溫：25℃；流動相：甲醇：0.1%磷酸=45：55；檢測器：UV和PDA；進樣量：5μl。

圖1 油菜蜂花粉高效液相色譜

圖2 油菜天然蜂巢花粉高效液相色譜

2.2.1 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分檢測方法

分別準確稱取蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉相同質量，定容于50ml，取5 μl進樣分析，得到如下色譜圖：蜂花粉見圖1、天然蜂巢花粉見圖2、仿生蜂巢花粉見圖3。

2.2.2 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分對比分析

由表1可知，根據色譜分析的色譜峰保留時間和色譜峰面積對照分析，仿生蜂巢花粉與天然蜂巢花粉之間的活性物質出峰位置完全一樣，活性物質非常接近，而仿生蜂巢花粉與蜂巢花粉之間的活性物質出峰位置也基本一樣，僅差一個峰的區別，其他活性物質非常接近；同時還發現仿生蜂巢花粉各活性物質的色譜峰面積有所增加，說明其活性物質的含量有所增加，仿生蜂巢花粉可以完全替代蜂巢花粉和蜂花粉。

2.2.3 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉的總黃酮對比測定

2.2.3.1 測定方法

(1)蘆丁標準曲線的制作[12]

稱取0.0099 g蘆丁溶解于100 ml甲醇溶液，搖勻，得標準液；取標準液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml分別置于10 ml容量瓶中，加入蒸餾水使成5 ml；精密加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 ml，搖勻，放置5min；再加入10%硝酸鋁溶液0.3 ml,搖勻，放置6min；再加入4% NaOH溶液4 ml；各用蒸餾水定容至刻度線，搖勻，放置10min。在510nm處測定吸光度，制作標準曲線。

（2）實驗組

稱取仿生蜂巢花粉0.0275 g，用甲醇定溶至50 ml容量瓶中；稱取蜂花粉0.0126 g，用甲醇定容至50 ml容量瓶中；稱取天然蜂巢花粉0.0249 g，用甲醇定容至50 ml容量瓶中備用。

取仿生蜂巢花粉、蜂花粉和天然蜂巢花粉甲醇溶液5 ml加入到10 ml容量瓶，加入蒸餾水使成5 ml；精密加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 ml，搖勻，放置5min；再加入10%硝酸鋁溶液0.3 ml,搖勻，放置6min；再加入4%NaoH溶液4 ml；各用蒸餾水定容至刻度線，搖勻放置10min。在510nm處分別測定吸光度。

表1 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉之間活性物質含量峰值面積對比表

2.2.3.2 實驗結果

依據標準曲線測定蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉總黃酮含量見表2。

2.2.4 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉總多糖對比測定

(1)測定方法—標準曲線的制作

準確稱取葡萄糖標準品適量，配制成含量為129.465mg/l標準溶液，分別移取該標準溶液0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml于具塞比色管，各精密加入5.0%苯酚溶液1.0 ml，搖勻，迅速精密加入硫酸5.0 ml，搖勻，放置10分鐘，置于40℃水浴中保溫15分鐘，取出迅速冷卻至室溫，以相應試劑為空白，依照紫外可見光譜儀在490nm波長處測定吸光度檢測，系列標準溶液葡萄糖含量分別為：25.893μg、51.786μg、77.697μg、103.572μg、129.1975μg、258.93μg，測得該系列標準溶液吸光度值分別為：0.291、0.429、0.553、0.707、0.829、1.197、1.468，空白溶液吸光度值為0.125，得標準曲線如下圖：

（2）蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉總多糖測定

依據標準曲線測定蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉總多糖含量見表3。

圖3 油菜仿生蜂巢花粉高效液相色譜

2.2.5 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉淀粉酶、蛋白酶的對比測定

淀粉活性酶測定按GB/T18932.16-2003方法，蛋白活性酶測定按GB/T23527-2009方法進行測定，測定結果見表4：

表2 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉的總黃酮含量結果

表3 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉的總多糖含量結果

表4 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉淀粉酶、蛋白酶測定結果

3 結論

蜂巢花粉是蜜蜂真正的天然食物，是蜜蜂采集植物花粉過程或在蜂房內摻入自身唾液與蜂蜜后釀造成熟的產品，蜜蜂及其幼蟲缺食蜂巢花粉，將造成群勢下降、幼蟲不能完全羽化。根據蜜蜂釀制花粉的原理，我們采用多級發酵技術確立了仿生蜂巢花粉的制備方法；通過蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉（三種材料都是油菜花粉）對比研究試驗，根據色譜分析的色譜峰保留時間和色譜峰面積對照分析，仿生蜂巢花粉與天然蜂巢花粉之間的活性物質出峰位置完全一樣，活性物質成分非常接近，而仿生蜂巢花粉與蜂巢花粉之間的活性物質出峰位置也基本一樣，僅差一個峰的區別，其他活性物質成分也非常接近；同時還發現，仿生蜂巢花粉各活性物質的色譜峰面積有所增加，說明其活性物質的含量有所增加，因此仿生蜂巢花粉可以完全替代蜂巢花粉和蜂花粉。同時，還發現仿生蜂巢花粉中的活性化學成分含量高于蜂花粉、蜂巢花粉的含量，另外通過對不同花粉淀粉酶、蛋白酶的對比檢測試驗，發現仿生蜂巢花粉中，這兩種活性酶的含量與蜂巢花粉的含量十分接近。

致謝：本課題研究受甘肅省科技支撐計劃《多級仿生蜂花粉的制造及其制劑的制備研究》（No：0708NKCE080，2009-2011）、《仿生蜂花粉系列制劑產業化開發》（No：1204 NKCE102,2012-2014）及《天水蜂產品品質優化工藝技術研究與開發》（No：144NKCE244,2014-2015）的支持，表示感謝。

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