AQP1和AQP3在宮頸癌新輔助化療前后的表達變化及意義

蔣珊珊 沈燕 李凱強 趙宇

●論 著

AQP1和AQP3在宮頸癌新輔助化療前后的表達變化及意義

蔣珊珊 沈燕 李凱強 趙宇

目的 觀察新輔助化療前后宮頸癌組織中水通道蛋白1（AQP1）與水通道蛋白3（AQP3）表達的變化，探討兩者在宮頸癌新輔助化療中的意義。方法 選擇宮頸鱗癌患者30例，術前接受以順鉑為基礎的有效新輔助化療。化療前和手術中分別取癌組織標本，應用RT-PCR法、Western blot法和免疫組化法對水通道蛋白（AQPs）的mRNA、蛋白和組織分布進行檢測。 結果化療后AQP1和AQP3的mRNA表達量約為化療前的3倍和2.7倍，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。AQP1和AQP3蛋白在宮頸癌組織中大量表達，在細胞膜和胞質中均有分布，化療后表達量提高，以胞質更為明顯。30例患者經過化療后，其中19例完全緩解，11例部分緩解。完全緩解組患者化療后AQP1和AQP3的mRNA和蛋白表達的增值雖然均大于部分緩解組，但差異均無統計學意義（均P＞0.05）。 結論 AQP1和AQP3在新輔助化療后宮頸癌組織中的表達增加，增幅可能與化療效果相關。

新輔助化療 宮頸癌 水通道蛋白1 水通道蛋白3

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一。據報道，每年全球約有53萬新發宮頸癌患者，約27.5萬人死于宮頸癌[1]。手術和放療是宮頸癌的主要治療方法，然而，盡管手術技巧、放療設備和技術的不斷改進，但宮頸癌的治療效果并無根本性的提高，總的5年生存率仍徘徊在40%左右[2]。新輔助化療的出現，為局部晚期宮頸癌患者爭取了手術機會，并提高了放療的敏感性。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一組跨膜轉運水和小分子物質的特異通道蛋白質家族，在哺乳動物中共發現13種AQP亞型（AQP0～AQP12）[3]。近來的研究表明AQPs在腫瘤的發生、發展中起到重要的作用。AQPs在多種腫瘤組織中異常表達，已證實AQP1和AQP3在宮頸癌中表達顯著[4]。卵巢癌、結直腸癌模型的研究均提示AQPs與抗腫瘤藥物的效果具有相關性[5-6]。然而，關于AQPs與宮頸癌化療藥物療效的相關研究尚未見報道。本研究擬探討宮頸癌組織中AQP1與AQP3在新輔助化療前后的表達變化，以及與化療效果的相關性。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2014年1月至2016年1月在浙江省人民醫院婦科手術治療的宮頸鱗癌患者30例，年齡37～69歲。病例入選標準：（1）臨床分期為Ⅰb2或Ⅱa2期；（2）手術病理確診為鱗狀細胞癌；（3）宮頸呈外生型生長，局部病灶≥4cm；（4）心肺功能良好，無化療及手術禁忌癥。所有患者均在術前接受2～3個周期的以順鉑為基礎的化療。經患者同意，化療前和手術中分別取癌組織標本存入液氮罐中備用。

1.2 化療效果評估 所有患者完成2～3個周期的化療后2周，對于可測量實體瘤按照1979年WHO抗瘤藥物客觀療效標準評價療效：（1）完全緩解：全部可測量病灶完全消失持續4周；（2）部分緩解：病灶的最大直徑與最大垂直橫徑乘積總和減少50%以上，持續至少4周：（3）穩定：各病灶最大直徑與最大垂直橫徑乘積總和減少＜50%，或增大＜25%，持續至少4周且無新病灶出現；（4）進展：病灶的最大直徑與最大垂直橫徑乘積總和增大＞25%，或出現新的病灶。（1）、（2）為有效，（3）、（4）為無效。

1.3 RT-PCR法檢測AQP1、AQP3 mRNA的表達水平采用Trizol試劑盒法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用TaqMan探針法，設計引物探針AQP1、AQP3、βactin，以β-actin為參照，熒光標記為FAM染料，在美國ABI公司的7500 PCR儀上進行操作。PCR循環參數為：95℃10min預變性；然后95℃15s，60℃1min，并檢測熒光信號，共40個循環。每個樣本重復3次，取平均值。反應結束后得出熒光反應曲線及CT值。

1.4 Western blot法檢測AQP1、AQP3蛋白的表達水平提取總蛋白，利用一抗結合AQP1、AQP3，Western blot法檢測化療前后各指標的表達情況。Western blot過程：轉印膜脫脂奶粉封閉后，一抗孵育24h，TBST洗膜，以HRP標記的二抗孵育。再洗膜后加入ECL底物顯影、曝光，掃描膠片。

1.5 免疫組化法檢測組織中AQP1、AQP3蛋白的分布組織經固定、脫水、石蠟包埋、切片，使用免疫組化SP法檢測。玻片脫蠟，微波修復，山羊血清室溫孵育30min，一抗（AQP1、AQP3）孵育過夜，二抗室溫孵育30min，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液室溫孵育15min，DAB顯色，蘇木素復染，淡氨水返藍，樹脂封片，光鏡下觀察。

1.6 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以 表示，化療前后AQP1和APQ3的表達水平比較采用配對秩和檢驗，不同化療效果患者化療前后AQP1和APQ3的表達水平變化比較采用兩獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 化療后基本情況 30例患者經過化療后，其中19例完全緩解，11例部分緩解，化療效果均為有效。

2.2 化療前后宮頸癌組織中AQP1和AQP3 mRNA的表達變化 RT-PCR法檢測結果顯示，化療后AQP1 mRNA的表達量約為化療前的3倍（3.19∶0.99），而化療后AQP3 mRNA的表達量約為化療前的2.7倍（2.70: 0.99），差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 化療前后宮頸癌組織中AQP1與AQP3mRNA表達量的變化

2.3 化療前后宮頸癌組織中AQP1和AQP3蛋白的表達變化 Western blot法檢測結果顯示化療后宮頸癌組織中AQP1及AQP3蛋白的表達量較化療前均有明顯增加（均P＜0.05），見表1、圖2-3。

表1 化療前后宮頸癌組織中AQP1和AQP3蛋白的表達變化

圖2 Western blot法檢測化療前后宮頸癌組織中AQP1和AQP3蛋白表達的電泳圖

2.4 化療前后AQP1和AQP3蛋白在宮頸癌組織中的分布 AQP1和AQP3蛋白在宮頸癌組織中大量表達，在細胞膜和胞質中均有分布?；熀髮m頸癌組織中AQP1和AQP3蛋白的表達量增加，以胞質更為明顯，見圖4。

圖3 化療前后宮頸癌組織中AQP1與AQP3蛋白表達量的變化

圖4 化療前后AQP1與AQP3蛋白的免疫組化結果（×200）

2.5 不同化療效果組化療前后AQP1和AQP3的表達變化 按照化療效果分組，完全緩解組患者新輔助化療后AQP1和AQP3的mRNA和蛋白表達的增值雖然均大于部分緩解組，但差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 不同化療效果組化療前后AQP1和AQP3的表達變化

3 討論

宮頸癌是威脅女性健康的最主要的婦科惡性腫瘤之一。新輔助化療給晚期宮頸癌患者帶來了希望，但是化療效果的個體差異又使新輔助化療的推廣疑慮重重。近年來的研究篩選出了一些分子標記物[7-8]，這些分子標記物與宮頸癌化療效果具有相關性。

AQPs廣泛表達于機體的各部位，不僅在維持細胞內外的水平衡方面起到了重要的作用，而且在腫瘤生長、侵襲和轉移的病理過程中也扮演了重要的角色。筆者前期研究發現，AQP1在正常宮頸組織、宮頸上皮內瘤變（CIN）和宮頸鱗癌組織間質的微血管內皮細胞上陽性表達，AQP1在CIN中的表達高于宮頸鱗癌和正常宮頸組織，在宮頸鱗癌中臨床Ⅰ期的表達高于臨床Ⅱ期；AQP3在正常宮頸組織、CIN、宮頸鱗癌的表達逐漸增高[4]。而AQP1在腫瘤血管內皮中的高表達，促進了腫瘤的生長浸潤，其介導的高滲透性引起流體靜力壓的增高，導致缺氧而促進血管生成[9]。本研究探究了有效的新輔助化療前后宮頸癌組織中AQP1和AQP3的變化，發現化療后AQP1和AQP3的表達均明顯上調，差異均有統計學意義，并且兩種蛋白在細胞膜和胞質的分布發生變化，提示AQP1和AQP3可能在新輔助化療治療宮頸癌的機制中起到促進作用，其相關的機制有待進一步研究。

其他惡性腫瘤的相關研究表明AQPs與化療效果有關。在卵巢癌體外實驗研究中，AQPs阻滯劑和高滲狀態可以增加卵巢癌細胞株SKOV3對順鉑的敏感性[5]。Shi等[6]利用結腸癌HT-29細胞為模型，AQP5的表達與化療療效正相關，并且推測是AQP5-P38 MAPK信號通路起作用。有關AQP1和AQP3與宮頸癌化療療效相關的研究尚罕見于報道。王曉云等[10]用免疫組化法檢測了36例宮頸鱗癌化療有效患者和54例無效患者，AQP1在敏感組宮頸癌中表達率為87.1%，高于無效組的表達率78.5%，但兩者差異無統計學意義。本研究中，新輔助化療后AQP1和AQP3 mRNA及蛋白水平的表達均明顯增高。而完全緩解組患者新輔助化療后AQP1、AQP3的mRNA和蛋白表達的增值大于部分緩解組，提示表達量的增幅可能與化療效果具有相關性。但本研究上述結果比較差異均無統計學意義，考慮與本研究樣本量較少，且缺少化療無效病例有關。今后需擴大樣本量，增加與化療無效組的比較，來進一步探討水通道蛋白在不同化療效果類型上的表達差異。

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Expression of AQP1 and AQP3 in cervical cancer patients with neoadjuvant chemotherapy

JIANG Shanshan,SHEN Yan，LI Kaiqiang,et al.Department of Gynecology,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

Neoadjuvant chemotherapy Cervical cancerAQP1 AQP3

2017-02-16）

（本文編輯:陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.10.2017-295

浙江省醫藥衛生計劃項目（2015KYB015）；浙江省自然科學基金項目（LQ17H160017）

310014 杭州，浙江省人民醫院婦科（蔣珊珊、沈燕），輸血科（李凱強）；溫州醫科大學附屬第二醫院婦產科（趙宇）

趙宇，E-mail：894867055@qq.com

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of aquaporin-1(AQP1)and aquaporin-3(AQP3)in cervical cancer patients with neoadjuvant chemotherapy. Methods Thirty patients with cervical cancer were enrolled in the study.Effective neoadjuvant chemotherapy with cis-platinum was given in all cases before surgery.Tumor specimens were obtained before chemotherapy and during surgery.The expression of AQP1 and AQP3 mRNA and protein was determined by RT-PCR,Western blot and immunohistochemistry,respectively.Results The mRNA expression of AQP1 and AQP3 increased 3 and 2.7 times after chemotherapy,respectively.The AQP1 and AQP3 proteins were expressed abundantly in both cytomembrane and cytoplasm of cancer tissue;and the protein expression increased significantly after chemotherapy,especially in cytoplasm.Among the thirty patients,19 cases achieved complete remission(CR)and 11 cases partial remission(PR)after chemotherapy.There was no significant difference in AQP1 and AQP3 expression between CR cases and PR cases,although there was a trend of increasing expression in CR patients. Conclusion Expression of AQP1 and AQP3 in cervical cancer is increased after neoadjuvant chemotherapy.