黃瓜品種田間性狀比對與部分品種SSR指紋圖譜的構建分析

賀長征+劉峰+周瑩

摘 要： 對搜集到的150個品種進行田間品種對比試驗，于2016年篩查出30個高產優質黃瓜新品種進入下一輪田間種植試驗，同時通過田間性狀比對發現部分品種類型相似。依照《NY/T2474—2013 黃瓜品種鑒定技術規程SSR分子標記法》標準，構建了44個品種的指紋圖譜，并以指紋數據為基礎利用NTsys分析軟件構建了品種聚類圖，依據標準中的判定標準發現4組（共計10個品種）疑為同品種，7組（共計20個品種）為近似品種，最后對田間性狀相似品種和SSR鑒定相似品種進行了比較分析。

關鍵詞： 黃瓜；SSR；品種真實性；指紋數據；聚類分析

中圖分類號：S642.2 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.06.003

Abstract： The field varieties of 150 varieties were compared and tested. In 2016， 30 new varieties of high yield and good quality cucumber were screened and entered the next round of field planting experiment. At the same time， it was found that some varieties were similar by field character comparison. The fingerprints of 44 cultivars were constructed according to “NY/T2474-2013 the technical standard of cucumber variety identification and SSR molecular marker”. Based on the fingerprint data， the dendrogram was constructed by using NTsys analysis software. 4 groups （10 varieties） were suspected to be of the same breed， and the 7 groups （20 varieties） were approximate varieties. Finally， a comparative analysis was made on similar varieties and similar varieties of SSR identification.

Key words： cucumber； SSR； varieties authenticity； fingerprinting data； cluster analysis

黃瓜（Cucumis Sativus L.）屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）甜瓜屬（Cucumis），一年生蔓性或攀援草本植物，在我國已有1500多年的栽培歷史[1]。作為世界十大蔬菜之一，黃瓜在全球的栽培面積僅次于番茄[2]，我國的黃瓜生產總面積與總產量在世界位居榜首，且黃瓜還是我國保護地栽培作物中第一大蔬菜作物[3]。黃瓜肉質脆嫩、汁多味甘，早已實現周年供應，其育種研究多次列入國家級項目[4]，我國在黃瓜育種工作中不斷獲得重大進展。黃瓜產業是天津市的技術優勢產業，種植面積達每年1.2×104 hm2，每年產量76×104 t。隨著黃瓜產業的快速發展以及國家政策的不斷放開，大量種子公司不斷涌現，造成了目前黃瓜種業市場秩序混亂，小、散、亂現象特別突出，嚴重危害了品種所有企業的利益，導致國內黃瓜主導企業優勢地位和市場占有率下降，影響了黃瓜種業的有序發展，給生產造成極大損失。

國際植物品種權保護組織（UPOV， 2005）在BMT測試指南草案中，將構建DNA指紋數據庫的標記方法確定為SSR和SNP，其中SSR具有按照孟德爾遺傳方式分離、共顯性遺傳、位點數量多、多態性高、試驗程序簡單等優點[5]，在農作物品種鑒定的研究上得到了廣泛的應用。在黃瓜品種真實性的鑒定方法中，田間種植鑒定方法直觀、可靠，但是費時、費工、成本高，需要2～3個月才能出結果，周期長、工作量大、且易受環境因素的影響[3]。2009年，黃瓜全基因測序的完成[6]，分子標記技術的快速發展，使得利用分子標記技術進行品種的真實性鑒定成為可能。2014年4月，《NY/T 2474—2013 黃瓜品種鑒定技術規程SSR分子標記法》實施，為我國規范黃瓜種業提供了標準支撐。本研究旨在對搜集到的150個品種進行田間品種對比試驗，并隨機選擇44個品種進行指紋圖譜構建、真實性鑒定和遺傳距離分析等實驗室研究工作。

1 材料和方法

1.1 材 料

以天津市優勢產業單位天津科潤黃瓜研究所、天津德瑞特種業有限公司研發的新品種為主要對象，同時搜集北京、廣東、山東、上海等地市場上各種類型的黃瓜栽培品種，共收集到黃瓜新品種150個。對收集的樣品分類整理、編號，進行品種真實性鑒定標準的技術開發與應用研究，同步安排田間比對試驗。

35對SSR引物序列來自于NY/T 2474—2013，編號依次為CU01-CU35，全部由ABI公司合成。PCR反應中的dNTP和Taq酶購自北京柏樹美生物技術有限公司（Genacea）。

1.2 方 法

1.2.1 田間試驗 對項目收集的150個黃瓜品種樣品安排田間對比試驗。試驗地點為天津市科潤黃瓜研究所，2016年3月28日大棚直播，每品種播一行，對照品種為津優35。田間調查記載性狀為節位、瓜長、把長、色澤、抗病性、產量等。

1.2.2 DNA提取 黃瓜干種子DNA提取方法：隨機數取30粒種子，加入適量石英砂，德國Restech研磨儀，頻率29 frequency·s-1，時間30 s至粉末狀，取樣100 mg左右至離心管，利用天根植物DNA提取試劑盒，按照步驟提取，所提DNA經K5500超微量分光光度計測量DNA的濃度和純度，-20 ℃保存備用。

1.2.3 PCR擴增 PCR擴增采用384孔板12 μL體系進行（表1）。PCR反應程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 5 min；16 ℃保存。

1.2.4 等位基因檢測 將35對黃瓜SSR引物根據等位基因變異范圍和顏色將其分成8組（表2），同一組內引物PCR產物混合，將每一對PCR產物稀釋13倍。從混合液中吸取1 μL加入到DNA分析儀（ABI 3500XL）深孔板中。板中各孔加入0.1 μL LIZ500分子量內標和8.9 μL去離子甲酰胺。將樣品在PCR儀上95 ℃變性5 min，4 ℃保存。瞬間離心10 s后上機電泳。

1.3 數據記錄和統計分析

（1）數據記錄。使用DNA分析儀3500XL的片段分析軟件Genemapper，編寫Panel，讀出每個位點每個樣品的等位基因擴增片段大小數據。

（2）數據統計分析。利用NTSYS-pc 軟件（Version 2.10e）計算Dice遺傳相似性系數GS=2a/（2a+b+c）。其中：a為任意兩品種共享譜帶數；b和c為相應兩品種間的差異條帶。用UPGMA（Unweighted pair grouping method with arithmetic mean）法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 田間調查結果

2016年5月12日至6月29日共摘瓜21次。根據試驗結果，篩查出30個高產優質黃瓜新品種進入下一輪田間種植試驗（表3），同時通過田間性狀比對發現部分品種類型相似（表4）。

2.2 44份黃瓜品種指紋數據

使用DNA片段大小分析軟件，讀出每個位點每個樣品的等位基因擴增片段大小數據，利用SSR數據處理宏程序DataTrans1.0[7]將片段大小數據轉化為1和0，構建品種的指紋數據（表5）。

2.3 44份品種聚類分析

利用NTSYS-pc 軟件（Version 2.10e）計算Dice遺傳相似系數，用UPGMA法進行聚類分析。44個品種在遺傳相似系數為0.81的時候聚為一類（圖1），品種整體上遺傳基礎狹窄。品種間的遺傳距離較近也反映了黃瓜育種種質間遺傳距離狹窄，黃瓜育種若在遺傳基礎狹窄的種質基礎上增大品種間的特異性困難就很大。提高黃瓜育種種質本身的遺傳多樣性，加大不同地區的黃瓜種質材料的交換使用，加強不同育種單位之間育種工作的合作，是提高黃瓜品種特異性的一條重要途徑。

在遺傳相似系數為1時，10個品種分為4組：①②③④。津綠30-8和博杰616為①組，指紋數據完全相同，疑為同品種，依次類推其他3組。在遺傳相似系數大于0.98時，20個品種分為7組：I～VII，指紋數據僅有1個位點差別，為近似品種（圖2）。

2.4 田間性狀相似品種和SSR鑒定相似品種比較分析

在隨機選擇的44份用于SSR指紋分析的品種中，有17個品種為田間性狀相似品種。17個品種分別為德瑞特8-9B，博耐E02，金胚98，津綠21-10，盛豐908，蔬春寶秀，騰達黃瓜，乾德二號，佳育908，中研二十一優，中華518，大澳001，盛美186，瑞新金寶，中研十九，妙收冠軍，佳育18。

17個田間性狀相似品種中，SSR指紋數據分析結果為近似品種的有11個，分別為德瑞特8-9B，博耐E02，金胚98，津綠21-10，盛豐908，蔬春寶秀，乾德二號，中研二十一優，中華518，瑞新金寶，妙收冠軍。

SSR指紋數據分析結果為近似品種中的9個品種，在2016年田間性狀比較中未被記錄為相似品種，分別為津綠30-8，博杰616，博杰100，津優301號，津優35號，津綠1900，盛美190，博杰105和華夏617。

在2017年的田間性狀觀察中，應重點記錄上述9個品種的田間數據，進一步加強SSR在品種真實性鑒定中的作用。

3 結 論

本研究對搜集到的150個品種進行田間品種對比試驗，于2016年篩查出30個高產優質黃瓜新品種進入下一輪田間種植試驗，同時通過田間性狀比對發現有24個品種類型相似。利用SSR技術構建了44個品種的指紋圖譜，應用NTsys分析軟件構建了品種聚類圖，發現20個品種為相似品種。分析表明，17個田間性狀相似品種中，使用SSR指紋數據分析結果發現為近似品種的有11個。SSR指紋數據分析結果為近似品種的9個品種，在2016年田間性狀比較中未被記錄為相似品種，在2017年的田間觀察中應詳細記錄并分析研究。

參考文獻：

[1]周長久.蔬菜種質資源概論[M].北京：北京農業大學出版社，1995：163.

[2]李懷智.我國黃瓜的栽培現狀及其發展趨勢[J].蔬菜，2003（8）：3-4.

[3]程周超.黃瓜SSR遺傳圖譜的構建及黃瓜重要農藝性狀的QTL定位[D].北京：中國農業科學院蔬菜花卉研究所，2010.

[4]顧興芳，張圣平，王燁.我國黃瓜育種研究進展[J].中國蔬菜，2005（12）：1-7.

[5]EUJAY L，SLEDGE M K ，WANG L. Medicago truncatula EST-SSRs reveal cross-species genetic markers for medicago spp[J].Theor appl genet，2004，108（3）：414-422.

[6]REN Y， ZHANG Z H， LIU J H. An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome[J].Plos one，2009，4（6）：e5795.

[7]蓋紅梅，任民. SSR 數據處理宏程序 DataTrans 1.0[J].分子植物育種，2011（9）：48.