UPLC—MS/MS法測定雞蛋、雞肉中4種氟喹諾酮類藥物殘留

門婷婷+劉晨+劉珂飛

摘 要：建立雞肉和雞蛋中諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星殘留檢測的UPLC-MS/MS方法。樣品采用2%甲酸乙腈溶液兩部提取之后氮吹的方法，HESI源正離子模式掃描，在選擇反應監測模式（SRM）下進行特征母-子離子對信號采集。根據保留時間和母離子及兩個特征子離子信息進行定性分析，9 min內完成4種氟喹諾酮沙星類藥物的定量分析。結果顯示，方法檢測底限為0.5 μg·kg-1，在10，20，40 μg·kg-1添加水平下，雞肉加標回收率在70%～90%，雞蛋加標回收率在80%～100%，且兩種樣本RSD值均<10%。該方法前處理簡便快速，分析速度快，靈敏度高。

關鍵詞：氟喹諾酮類藥物；超高效液相-串聯質譜法；雞蛋；雞肉

中圖分類號：S859.84 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.06.009

Abstract： The paper established the UPLC-MS/MS method to determine the residues of norfloxacin，ciprofloxacin，enrofloxacin，ofloxacin in the chickens and eggs. The samples were extracted by 2%formic acid in acetonitrile for two times and blow dry through termovap sample concentrator. The samples was positive ion mode scanning by heated electro spray ionization（HESI）， and the signal collection of characteristic maternal ions and sub-ion pairs was conducted by the selective reaction monitor（SRM）. The qualitative analysis was conducted on the basis of retaining time， maternal ions and the two characteristic sub-ion， and the quantitative analysis of chloramghenicol was conducted in 9 minutes. On the condition that the detection limit was 0.5 μg·kg-1 and 10，20，40 μg·kg-1 addition level， the recovery rate in chickens and eggs was 70%～90% and 80%～100% respectively， and the RSD between the two kinds of samples was less than 10%. The methods had the advantage of simple and fast on the pretreatment， quick analysis and high sensitivity.

Key words： fluoroquinolones drug； UPLC-MS/MS； chicken； eggs

氟喹諾酮類抗生素是一類人畜通用的藥物。因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性和毒副作用小等特點，被廣泛應用于畜牧、水產等養殖業中，包括在雞、鴨、鵝、豬、牛、羊、魚、蝦、蟹等的養殖中用于疾病防治[1]。由于氟喹諾酮類藥物在動物機體組織中的殘留，人食用動物組織后氟喹諾酮類抗生素就在人體內殘留蓄積，易造成人體疾病對該藥物的嚴重耐藥性，影響人體疾病的治療，從而影響該類藥物的臨床療效[2]。因此，氟喹諾酮類藥物殘留問題越來越引起人們的關注。目前，有多種檢測氟喹諾酮類藥物殘留的方法[3-7]，其中包括液相色譜-串聯質譜法、酶聯免疫試劑盒、氣相色譜法、毛細管電泳法等。本研究建立了檢測雞蛋和雞肉中4種常見氟喹諾酮類藥物的多殘留檢測方法，采用超高效液相串聯質譜法，能簡便、快速地對雞肉和雞蛋進行定量分析檢測。

1 材料和方法

1.1 儀 器

超高效液相色譜-串聯三重四級桿質譜儀：Thermofisher Dionex Ultimate 3000 RSLC - TSQ QUANTUM ACCESS MAX，配有電噴霧離子源（HESI源）；瑞寧微量移液器；VDRTEX-5-H106漩渦混合器（江蘇其林貝爾）；GL-20G-II高速冷凍離心機（上海安亭）；TTL-DCI氮吹儀（北京同泰聯）；超純水儀（MILLIPORE Synergy）

1.2 藥品和試劑

諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星標準品購于中國獸醫藥品監察所。乙腈、甲酸、正己烷為色譜純，購于美國Thermofisher公司，試驗用水由 MILLIPORE Synergy制得。

1.3 檢測條件和方法

1.3.1 液相色譜與質譜條件 液相色譜柱：Hypersil Gold-C18，1.9 μm，2.1 mm×100 mm；流動相，0.1%甲酸水-甲醇；流速0.35 mL·min-1；進樣量，10 μL。流動相：A為甲醇，B為0.1%甲酸水；0～1.5 min，A為10%，B為90%；1.5～5.5 min，A由10%變化至90%，B由90%變化至10%；5.5～7 min ，A為90%，B為10%；7～9 min，A為10%，B為90%。

質譜掃描方式：正離子掃描，檢測方式，多反應監測；電噴霧電壓，3 800 V；霧化溫度，400 ℃；輔助氣流速10 arb ；鞘氣流速，35 arb；毛細管溫度，350 ℃。質譜采集參數見表1。

1.3.2 標準品溶液的制備 精密稱取4種沙星類標準品10 mg，加乙腈至100 mL，制成100 μg·mL-1的溶液，做為標準品儲備液，-4 ℃冰箱保存。儲備液繼續用流動相初始溶液稀釋成100 ng·mL-1，做為對照工作液使用。

1.3.3 樣品提取和凈化 前處理過程：準確稱取雞肉、雞蛋粉碎樣品5 g（精確至0.01 g），置于50 mL具塞聚四氟乙烯離心管中，準確加入10 g預先灼燒后的無水硫酸鈉，并用玻璃棒攪勻，然后加入20 mL2%甲酸乙腈。用玻璃棒混勻均質提取5 min，5 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液置于離心管中，另取20 mL 2%甲酸乙腈到另一50 mL離心管中，并清洗玻璃棒，清洗液倒入第一個離心管中對雞肉進行重復提取，合并兩次提取液并渦旋混勻。

凈化過程：將前處理提取液取出8 mL在55 ℃下氮吹吹干，加入2 mL流動相初始溶液進行渦動溶解，溶解后加入1 mL10%甲醇飽和的正己烷渦旋混合30 s，8 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，用10%甲醇飽和的正己烷重復凈化2～3次，直至下層透明清亮，取出下層過0.2 μm有機濾膜置2 mL樣品瓶中供UPLC-MS/MS測定。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的選擇

2.1.1 流動相條件的選擇 本試驗對比了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水作為流動相進行對比選擇。結果表明，有甲酸存在的流動相體系對氟喹諾酮類抗生素具有較好的分離能力且對出峰時產生的拖尾現象有較好的改善，證明流動相中加入甲酸能提高質譜的檢測靈敏度，增加樣品離子化效率。在對甲醇和乙腈的選擇上，考慮到試劑本身的性價比問題，流動相體系選擇甲醇-0.1%甲酸水就完全可以滿足試驗的要求。在流動相比例調整過程中發現，在流動相短時間內變化比較大的情況下，出峰峰形效果越好，對峰形的毛刺、拖尾的現象越有明顯改善，在計算峰形面積時，不經過平滑即可得到可靠的數據。

2.1.2 質譜條件的選擇 對4種沙星進行質譜條件優化，在正離子模式條件下得到最佳離子碰撞能量和Tube Lens值。在電噴霧電壓、霧化溫度、輔助氣流和毛細管溫度等質譜參數的不同變化的情況下，比較樣品出峰情況和信號響應值，最終得到最佳條件分別為電噴霧電壓3 800 V；霧化溫度400 ℃；輔助氣流速10 arb ；鞘氣流速35 arb；毛細管溫度350 ℃。具體TIC圖見圖1。

2.2 標準曲線線性考察

取適量標準儲備液，用流動相初始溶液對4種沙星標準儲備液進行混合并稀釋成系列濃度為0.5，1，2，4，8 ng·mL-1的標準工作液，從低濃度到高濃度進行測定，每一濃度進樣3針，按其所得峰面積與相應標準工作液的濃度作標準曲線（表2），并依次計算回歸方程及相關系數，最后繪制標準曲線。

2.3 添加回收和精密度試驗

準確量取100，200，400 μL對照工作液加入到5 g樣品中，每個添加濃度制備3份平行樣，每份樣品進樣3次，取平均值。核算9個回收率測定結果并計算相對標準偏差（RSD）。

由表3知：雞肉中4種氟喹諾酮抗生素陽性添加樣品的回收率普遍在70%～90%，批間內變異系數均<10%；雞蛋中4種氟喹諾酮抗生素陽性添加樣品的回收率普遍在80%～100%，批間內變異系數均<10%。向實際樣品添加氟喹諾酮抗生素標樣來確定本方法的檢測底限，考慮到樣品基質的干擾性及信噪比要求，經試驗數據確定本方法的檢測底限（LOQ）為0.5 μg·kg-1。

3 結 論

本文建立了測定雞蛋、雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留的UPLC-MS/MS方法。通過樣品前處理以及儀器的各項參數的優化，找出了最佳的樣品提取方法，并使儀器檢測靈敏度達到最優化。該方法的檢測底限（LOQ）為 0.5 μg·kg-1，同時樣品前處理時省去了凈化過程，具有處理程序簡單、快速、測定準確率高等特點。

參考文獻：

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