石油污染鹽堿土壤生物修復模式研究

王靜蘭 汪志榮 冀大選

摘要[目的]尋找適宜的石油污染鹽堿土壤的野外生物修復模式。[方法]以實驗室前期保存和新篩選的石油降解細菌菌群為基礎，制備固體菌肥，首先在室內條件下研究C∶N∶P、菌肥施入量對降解率的影響，并將菌肥施入量、植物種類、土壤翻耕對野外土壤污染修復效果的影響進行試驗研究。[結果]菌肥的降解特性決定了石油污染物的降解效率，無效的菌肥在室內外試驗中都會削減石油污染物的修復效果；在適宜的土壤C∶N∶P條件下，新鮮菌肥的施入量增加，可有效提高石油污染物的降解率。足夠的菌肥施入量能夠在短期內（10～20 d）發揮高效降解作用。在野外修復模式研究中，翻耕對擾動鹽堿土壤的石油污染修復作用有限，土著優勢植物堿蓬比苜蓿更適于植物-微生物的聯合修復。[結論]在野外條件下，適宜的鹽堿土壤石油污染修復模式為堿蓬+10%新鮮菌肥+不翻耕+營養（C∶N∶P=100∶5∶3）。

關鍵詞鹽堿土壤；石油污染；固體菌肥；石油降解率；生物修復模式

中圖分類號S181.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）21-0049-05

Study on Bioremediation Mode of Saline Soil Contaminated by Petroleum

WANG Jinglan1， WANG Zhirong2*， JI Daxuan3

（1.Tianjin Lanyu Science and Technology Industry Trade Co. Ltd.， Tianjin 300384； 2. College of Environmental Science and Safety Engineering， Tianjin University of Technology， Tianjin 300384； 3. Tianjin Huanou Semiconductor Material Technology Co. Ltd.， Tianjin 300384）

Abstract[Objective]To find a suitable bioremediation model for petroleum contaminated saline soil. [Method]Based on the oildegrading bacteria flora saved by experiment previously and screened freshly， the solid fertilizer was prepared. The effect of C∶N∶P and the quantity of solid fertilizer on oildegradation rate and amount of microbe were studied， and the impact of quantity of solid fertilizer applied， kinds of plant， tillage on remediation of contaminated soil in the field were studied by experiment. [Result]Degradation characteristics of fertilizer determined the degradation efficiency of petroleum pollutants， remediation invalid fertilizer will reduce oil pollutants in both indoor and outdoor test. In the soil C∶N∶P under appropriate conditions， the fresh fertilizer application amount increased， which can effectively improve the degradation of oil pollutants. Enough fertilizer can play a role the degradation in the short term （10-20 d）. In the field remediation model， the effect of tillage on the remediation of contaminated saline soil was limited. The indigenous dominant plant Suaeda glauca was more suitable for phytoremediation than Medicago sativa. [Conclusion]Under field conditions， the appropriate bioremediation mode for saline soil contaminated by oil was Suaeda glauca + 10% fresh bacterial fertilizer +no tillage + nutrition （C∶N∶P=100∶5∶3）.

Key wordsSaline soil；Petroleum contamination；Solid fertilizer；Oil degradation rate；Bioremediation mode

鹽堿土壤的石油污染修復較單一的石油污染復雜和困難，單一的修復措施很難達到理想的效果，因此在實際污染土壤修復過程中，尋求適宜的修復模式十分必要。生物修復是目前國際上公認的較有前途的土壤污染修復方法之一[1-2]，相對于物理法和化學法，生物修復則對石油污染物的降解更為徹底，且可以避免土壤環境的二次污染，因此越來越受到人們的重視[3-4]。

從石油污染鹽堿土壤的生物修復機理來看，可將生物修復模式歸納為生物強化、生物刺激及二者的組合3種模式[5]。近年來，將菌肥用于生物強化修復取得了一定成果[6]。固體菌肥中微生物對環境適應能力較強，可極大地提高土壤修復效果[7-12]。Wang等[13]以從大港石油污染土壤篩選的石油降解細菌菌群為基礎，制備固體菌肥并用于輕鹽土的修復，60 d修復期結束后，石油降解率達52.91%。Zhang等[14]以草炭為固體材料，與2種石油降解菌混合制成固體菌肥，用于修復遼河油田石油污染土壤，60 d后石油降解率達到73.5%。Zhang等[15]研究了土壤生物修復過程中，菌肥施入量、C∶N∶P、溫度等影響因素在不同階段的影響順序，結果表明，不同降解時期菌肥施入量始終是降解主要影響因素。Gentili等[16]采用殼質角素和殼聚糖作為載體來固定紅球菌屬，進行原油污染海水修復，發現固定化細菌對海水污染物的去除比游離菌提高了約30%。

筆者以實驗室前期保存的石油降解細菌菌群活化后再馴化和在污染區篩選新制備的細菌菌群為基礎，以麥麩和鋸末作為固體介質制備固體菌肥，研究室內條件下的菌肥降解特性，分析菌肥施入量、C∶N∶P對降解率的影響，然后將室內實驗成果應用于野外生物修復模式，尋找管理容易、簡單易行的石油污染鹽堿土壤的強化和刺激組合修復模式。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗用土壤取自大港油田第四采油廠附近土壤，土壤理化性質分析（表1）表明，自然土壤未受石油污染，為低鹽堿土壤，將其配制成石油濃度為17 000 mg/kg的污染土壤。

用于制備菌肥的液體菌劑為天津大港油田石油污染土壤篩選馴化后獲得。將馴化后的液體菌劑擴大培養，以15%的接種量分別接入滅菌的固體介質（麩皮和鋸末質量比為1∶1）中，維持60%含水率，37 ℃下培養3 d。

室內、野外試驗均在第0天、第60天時施入菌肥。首次菌肥是經實驗室4 ℃、保存240 d的石油降解細菌菌群活化后再馴化制備；而第2次菌肥為篩選馴化后立即制備。固體介質為麩皮和鋸末（1∶1）。尿素調節土壤C∶N∶P。

1.2試驗方法

室內試驗土壤的C∶N∶P分別為100∶4∶3（原始比例）、100∶5∶3、100∶10∶3、100∶15∶3、100∶20∶3；菌肥施入量分別為0（CK）、5%、10%、15%。試驗在直徑15 cm、高15 cm的盆缽中進行，裝土1.5 kg/盆，2個平行，室溫，土壤水分維持20%左右。

45卷21期王靜蘭等石油污染鹽堿土壤生物修復模式研究

野外試驗地點為天津理工大學校園草地，修復試驗時間為6月2日—10月23日。試驗花盆中填入C∶N∶P為100∶5∶3的土壤，裝土量為2 kg/盆。

野外試驗共設4個方案，每個方案設3個處理，共12個處理，分別為堿蓬-無菌肥-不翻耕、堿蓬-10%菌肥-不翻耕、堿蓬-15%菌肥-不翻耕、堿蓬-無菌肥-翻耕、堿蓬-10%菌肥-翻耕、堿蓬-15%菌肥-翻耕、苜蓿-無菌肥-不翻耕、苜蓿-10%菌肥-不翻耕、苜蓿-15%菌肥-不翻耕、苜蓿-無菌肥-翻耕、苜蓿-10%菌肥-翻耕、苜蓿-15%菌肥-翻耕。修復時間105 d，定期采樣測定石油含量、植物株高和發芽率。采用三氯甲烷萃取-重量法測定石油含量。

2結果與分析

2.1菌肥降解特性的室內研究

2.1.1菌肥施入量對土壤石油降解率的影響。

在同一C∶N∶P，不同菌肥施入量條件下，石油降解率均呈現出隨著修復時間的延長而逐漸增加的趨勢（圖1）。

0～60 d，隨著菌肥施入量增大，降解率均維持在較低水平。這是由于初期投入的菌肥保存時間過長而失效，這一階段主要依靠土著微生物的降解，但引入的外源菌肥會對土著微生物產生競爭作用，導致有效降解的微生物并不占主導作用。與無菌肥相比，由新鮮菌液制成的菌肥對土壤石油的降解作用明顯。表現為，在60 d加入由新鮮菌液制成的菌肥后，初期降解率升幅較大，C∶N∶P=100∶5∶3、10%菌肥施入量條件下60～80 d石油降解率由11.55%提升至40.87%（圖1b）。這也表明菌肥微生物在石油污染物修復中起著決定性作用。

不同C∶N∶P比條件下，菌肥施入量對降解率影響不同。表現為，低C∶N∶P比（圖1a、圖1b）條件，隨著菌肥施入量的增大，石油降解率增加，但菌肥施入量達到10%后再增加施入量并不能保證降解率得到顯著增加；而較高比例（圖1c～圖1e）條件下，當菌肥施入量達到10%后再增加菌肥施入量，石油降解率呈現出不增反降的趨勢，表現為10%甚至5%的施菌肥量土壤的降解率最大。這說明石油污染土壤的生物修復受到菌肥施入量和C∶N∶P的共同影響。在適宜的C∶N∶P比下，新添加菌肥微生物能夠盡快適應土壤環境并在

短期內發揮高效降解作用。

2.1.2C∶N∶P對土壤石油降解率的影響。

從圖2可見，同一施菌肥量條件下，土壤的石油降解率隨著C∶N∶P比的增加呈現先增加后減小的趨勢。表現在10%菌肥施入量條件下（圖2c），100∶5∶3條件下的土壤石油降解率大于100∶4∶3條件下，

這是由于C∶N∶P為100∶4∶3時，土壤氮肥含量不足，難以維持降解微生物代謝需求，降解能力減弱；而土壤氮肥過量，會對降解微生物產生抑制作用，降解率下降。

由此可見，當土壤C∶N∶P滿足微生物代謝需求時，菌肥中的微生物才能發揮降解作用。因此，在適宜C∶N∶P下，隨著菌肥施入量的增加，降解率才能同步提升。綜合室內試驗條件，適宜菌肥降解的C∶N∶P為100∶5∶3，相應的適宜菌肥施入量為10%。因此，用于野外修復的C∶N∶P為100∶5∶3，菌肥施入量設置為10%、15%。

2.2野外生物修復模式研究

2.2.1植物生長狀況及石油降解率。

由表2可知，在含油量為17 000 mg/kg、含鹽量為0.402%的土壤中，堿蓬和苜蓿的生長均受到石油和鹽堿的雙重脅迫作用。表現在堿蓬-15%菌肥-不翻耕、苜蓿-15%菌肥-不翻耕在80 d的發芽率分別為73.46%、64.42%。由于堿蓬對于石油和鹽堿的耐受能力要優于苜蓿，因此堿蓬的生長狀況要優于苜蓿。值得注意的是，施入菌肥對堿蓬和苜蓿都有提高發芽率的作用。但菌肥的施入對長勢并沒有顯著的促進作用。堿蓬和苜蓿的發芽率在無菌肥時基本上在22 d左右達到最大并穩定，而施入菌肥會使堿蓬發芽期延長約10 d。菌肥施入量對植株的株高影響不顯著。

由圖3可知，堿蓬和苜蓿對土壤石油降解率的變化規律基本相同（圖3a、圖3b）。

在無菌肥施入條件下，修復初期二者降解率的差別并不明顯，但在修復后期堿蓬組的降解率要整體高于苜蓿組。這是可能由于前期土壤根系尚不發達，不論是堿蓬還是苜蓿，二者和土著微生物形成的根際效應差別不大，但在修復后期，隨著植物根系逐步發育良好，堿蓬作為大港的本土植物，與土著微生物之間的協同作用更為明顯。

有菌肥施入土壤中，在同一條件下，0～60 d堿蓬和苜蓿組的降解率差別不大，但均明顯低于無菌肥組。隨著微生物逐漸適應環境，植物根系逐漸發育良好，60 d后二次施入的菌肥加速了土壤石油的降解，降解率大幅提高。在同一條件下，對比堿蓬和苜蓿的修復效果可看出，堿蓬的修復效果優于苜蓿。這是由于堿蓬的根系生長狀況明顯優于苜蓿，植物-菌肥微生物的協同作用更為突出，因而更有利于菌肥微生物發揮降解作用。

2.2.2菌肥施入量對降解率的影響。

野外條件下，菌肥施入量對石油降解率的影響與室內條件相似。0～60 d施入降解能力退化的菌肥后降解率明顯小于無菌肥施入條件下的降解率。第2次施入新制備的石油降解菌肥（60 d）后，石油降解率在短期內（60～80 d）得以大幅度提升。表現在堿蓬-15%菌肥-翻耕的降解率由12.8%（60 d）升高至46.2%（80 d），80 d后降解率逐漸趨于平緩；同時，不論是種植堿蓬還是苜蓿，降解率均隨著菌肥施入量的增加而增加，但施入過量的菌肥降解率并未得到顯著的提高。經計算，修復結束后，堿蓬-15%菌肥-翻耕條件下降解率僅比堿蓬-10%-翻耕降解率高出4.66%；苜蓿-15%菌肥-翻耕條件下降解率僅比苜蓿-10%菌肥-翻耕降解率高出2.01%（圖3）。

2.2.3翻耕對降解率的影響。

圖4顯示，在不同菌肥施入量條件下，翻耕對石油降解率的促進作用有限。修復結束后，堿蓬在無菌肥施入條件下，翻耕僅將降解率提高了18個百分點，堿蓬在10%菌肥施入條件下，翻耕僅將降解率提高約30個百分點，15%菌肥下僅將降解率提高約2.0個百分點。

2.2.4室內、野外生物修復效果對比分析。

從圖5可以看出，0～60 d不論是室內條件還是野外條件降解率呈相同的變化趨勢，均隨著修復時間的延長呈現緩慢增加的趨勢。這說明土著微生物對土壤石油均有一定程度的降解。對比整個修復期間室內、野外同一條件的石油降解率不難發現，在野外條件下，植物的根系效應可以有效地提高石油降解率。105 d無菌肥施入時，野外條件比室內條件的降解率高出近

10%，分別為23.44%和32.54%（圖5a）。在有菌肥（10%、

15%）施入條件下，0～60 d從降解率來看，野外種植植物的條件并未呈現出優勢。這是由于一方面此時植物根系發育尚不成熟，二是由于初次投入的無效菌肥抑制了土著微生物降解作用的發揮，因此植物的根際效應并未呈現出優勢。

60～105 d施入新鮮菌肥后，野外條件的降解率要高于室內。修復105 d，10%菌肥條件下室內、野外的降解率分別為45.21%、47.83%（圖5b），15%菌肥降解率分別為4897%、5239%（圖5c）。這也表明土壤修復過程中，有效的降解微生物是土壤石油降解的主要動力，在降解微生物發揮作用的前提下，再施以適當的生物刺激（例如溫度、光照、植物）才能進一步強化微生物的降解作用。退化的菌肥嚴重影響土著微生物的降解作用的發揮，也弱化生物刺激手段的刺激能力。

與室內結果相似的是，在一定的土壤營養條件下，菌肥施入量達到一定量后進一步增加施入量對石油降解率的影響有限。

3結論

（1）菌肥微生物的特性是石油污染鹽堿土壤生物修復的決定性因素。長期保存的菌肥或菌液制備的菌肥都會退化，嚴重影響土壤修復效果，不宜使用；有效的降解微生物才是土壤石油降解的主要動力，起著強化作用，而植物是輔助的刺激作用。

（2）C∶N∶P是影響土壤生物修復的重要因素，在適宜的C∶N∶P條件下，隨著菌肥施入量的增加，石油降解率增加。該研究中石油污染鹽堿土壤修復適宜C∶N∶P為100∶5∶3，適宜菌肥施入量為10%。

（3）野外生物修復模式研究表明，擾動土壤條件下翻耕對降解的作用有限。

（4）相同條件下，作為土著耐鹽堿植物堿蓬，在降解率和生長狀況均優于苜蓿。

（5）石油17 000 mg/kg、含鹽量4 000 mg/kg土壤，野外最適宜修復模式為植物-微生物聯合強化與營養刺激模式，具體措施為C∶N∶P為100∶5∶3+種植堿蓬+10%新鮮耐鹽堿菌肥+不翻耕。

參考文獻

[1] AGAMUTHUA P，ABIOYEA O P，AZIZ A A.Phytoremediation of soil contaminated with used lubricating oil using Jatropha curcas[J].Journal of hazardous materials，2010，179（1/2/3）：891-894.

[2] JIA J P.The study on properties of microbiology and effect of bioremediation in petroleumcontaminated soil[D].Bejing：Tsinghua University，2005.

[3] GU C H，CHEN G Z.The study on ecological research conditions of biodegradation in petroleumcontaminated soil[J].Ecological sciences，2000，19（4）：67-72.

[4] LIU W X，LUO Y M，TENG Y，et al.Research advances in bioremediation of petroleumcontaminated soil[J].Soil，2006，38（5）：634-639.

[5] WANG J L.Study on bioremediation mode of saline soil contaminated by petroleum[D].Tianjin：Tianjin University of technology，2014.

[6] SU D，LI P J，JU J L，et al.Remediation of polycyclic aromatic hydrocarbons in nonfluid medium with immobilized microorganism technique[J].Chinese journal of applied ecology，2006，17（8）：1530-1534.

[7] SU D，LI P J，WANG X，et al. Biodegradation of benzo[a]pyrenein soil by immobilized fungus[J].Environmental engineering science，2008，25（8）：1181-1188.

[8] KUYUKINA M S，IVSHINA I B，KAMENSKIKH T N，et al.Survival of cryogelimmobilized Rhodococcus strains in crude oilcontaminated soil and their impact on biodegradation efficiency[J].International biodeterioration & biodegradation，2013，84：118-125.

[9] WANG Z Y，XU Y，WANG Y H，et al.Biodegradation of crude oil in contaminated soils by free and immobilized microorganisms[J].Pedosphere，2012，22（5）：717-725.

[10] MOHAMMADI A，NASERNEJAD B.Enzymatic degradation of anthracene by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium immobilized on sugarcane bagasse[J].Journal of hazardous materials，2009，161（1）：534-537.

[11] LEBEAU T，BAGOT D，JZQUEL K，et al.Cadmium biosorption by free and immobilised microorganisms cultivated in a liquid soil extract medium：Effects of Cd，pH and techniques of culture[J].Science of the total environment，2002，291（1/2/3）：73-83.

[12] WANG X，LI P J，SONG S Z，et al.Immobilization of introduced bacteria and degradation of pyrene and benzo（α） pyrene in soil by immobilized bacteria[J].Ecological sciences，2006，17（11）：2226-2228.

[13] WANG Z R，ZHU X Y，WANG W L，et al.Study on the preparation and application of the petroleumdegrading solid fertilizer[J].Journal of anhui agricultural sciences，2014，42（6）：1810-1812.

[14] ZHANG R L，LI X G，HUANG G Q.An applied research on the onsite bioremediation of contaminated soil in oil field by solid bacterial reagent s[J].Shanghai environmental sciences，2009，28（3）：97-100.

[15] ZHANG X X，BAI J J，XU N N，et al.Study on influencing factors of immobilized microorganisms for remedying oilcontaminated soil[J].Chinese journal of environmental engineering，2013，7（3）：1157-1162.

[16] GENTILI A R，CUBITTO M A，FERRERO M，et al.Bioremediation of crude oil polluted seawater by a hydrocarbondegrading bacterial strain immobilized on chitin and chitosan flakes[J].International biodeterioration & biodegradation，2006，57（4）：222-228.