蓖麻玆cAKT1基因的克隆與序列分析

包麗坤 耿學(xué)軍

摘要[目的]對蓖麻RcAKT1基因進行克隆和序列分析。[方法]提取鹽脅迫處理的蓖麻新鮮葉片總RNA，采取RACE法克隆蓖麻RcAKT1基因的3′末端和5′末端，利用生物信息學(xué)軟件DNAman對兩端序列進行拼接，最后設(shè)計一對特異性引物，從而獲得蓖麻RcAKT1基因的ORF全長序列，并對該序列進行生物信息學(xué)分析。[結(jié)果]該基因的開放閱讀框序列長度為2 253 bp，推測可不間斷編碼751個氨基酸。選取其他植物的AKT1序列與蓖麻RcAKT1序列進行比對，結(jié)果顯示同源性很高，其一致性在84%～97%。[結(jié)論]經(jīng)過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)蓖麻RcAKT1屬于ANK超級家族，是親水性蛋白質(zhì)。

關(guān)鍵詞蓖麻；內(nèi)整流K+通道蛋白基因；基因克隆；生物信息學(xué)分析

中圖分類號S188文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）21-0138-05

Cloning and Sequence Analysis of RcAKT1 Gene from Castor

BAO Likun，GENG Xuejun

（College of Life Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao，Inner Mongolia 028000）

Abstract[Objective]To clone and analyze RcAKT1 gene sequence from castor.[Method]The total RNA of castor fresh leaves was extracted and the RACE method was used to clone the 3 ′end and 5′ end of RcAKT1 gene. The twoterminal sequence was spliced by bioinformatics software DNAman.Finally，the ORF full length sequence of RcAKT1 gene was obtained and the bioinformatics analysis was carried out.[Result]The length of the open reading frame was 2 253 bp， the analysis predicted that 751 amino acids could be encoded without interruption. The AKT1 sequence of other plants was compared with the RcAKT1 sequence of castor.The results showed that the homology was high and the consistency was between 84% and 97%.[Conclusion]After bioinformatics analysis， it has been found that castor RcAKT1 belongs to the ANK super family and its a hydrophilic protein.

Key wordsCastor； ATK1；Gene cloning；Bioinformatic analysis

植物K+通道蛋白（Arabidopsis K+ transporter 1，AKT1）是一個在高親和鉀離子的吸收過程中發(fā)揮重要作用的內(nèi)向整流的鉀離子通道，它在植物中的主要作用是負(fù)責(zé)介導(dǎo)參與其對鉀離子的吸收以及鉀離子的運輸，在水分子的脅迫下可以降低蒸騰、關(guān)閉氣孔，進而有效地防止植物體內(nèi)水分流失，維持光合作用從而增加其抗逆性[1-2]。在很多抗逆性強的植物體內(nèi)的抗逆機制中，AKT1基因發(fā)揮了非常大的作用。因此，對該基因的研究具有很大的現(xiàn)實應(yīng)用性價值。

蓖麻（Ricinus communis L.）屬于大戟科植物，是一年生或多年生的草本植物。我國土地沙漠化越來越嚴(yán)重，且在農(nóng)業(yè)種植土地總面積當(dāng)中鹽堿土地面積一直占有很大的比例，由于在鹽堿土地上種植其他農(nóng)作物產(chǎn)量很低，所以大部分地區(qū)都選擇種植抗鹽堿性強的農(nóng)作物。蓖麻的適應(yīng)性相對于其他植物較強，其可在氣候干旱少雨、土地貧瘠且鹽堿含量高的地區(qū)進行種植，因此它的種植非常廣泛。此外，蓖麻的經(jīng)濟地位和應(yīng)用價值也非常高，現(xiàn)已被應(yīng)用到了各行各業(yè)，目前對蓖麻的抗逆性研究較少。該研究以蓖麻為材料，采用RACE（rapidamplification of cDNA ends）等技術(shù)，獲取蓖麻K+通道蛋白基因RcAKT1，并進行生物信息學(xué)分析，為進一步研究RcAKT1基因的轉(zhuǎn)化及功能驗證奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料蓖麻品種為通蓖5號，

首先對蓖麻進行鹽脅迫預(yù)處理，待其長出3片真葉后，將新鮮葉片用液氮進行速凍保存，作為試驗材料備用。Ex Taq DNA聚合酶、克隆載體PMD18-T、3′RACE 試劑盒以及5′RACE 試劑盒均來自寶生物工程（大連）有限公司，大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞采用鈣離子處理法制備，并且保存于實驗室超低溫冰箱內(nèi)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1蓖麻葉片總RNA的提取及引物設(shè)計。創(chuàng)造一個無RNase的環(huán)境，使用改良的Trizol提取法在蓖麻新鮮葉片中提取總RNA，將沒有蛋白質(zhì)和DNA污染、降解程度低、豐度高的總RNA進行分裝保存。該試驗以RNA為模板，采用RACE法克隆蓖麻RcAKT1基因cDNA的全長序列[3]。根據(jù)其他親緣關(guān)系較近植物中RcAKT1基因的進化保守區(qū)域序列，利用Premier 5.0軟件，設(shè)計出一對3′RACE簡并性引物：BMF1和BMF2。結(jié)合獲取的蓖麻RcAKT1基因3′末端序列，再利用Premier 5.0軟件，設(shè)計出一對5′RACE特異性引物：BMR1和BMR2。將經(jīng)公司測序得到的核苷酸3′末端序列以及5′末端序列利用DNAman軟件進行電子序列拼接，最終獲得cDNA全長核苷酸序列。找出該基因序列的開放閱讀框，在序列編碼區(qū)兩端設(shè)計出一對全長特異性引物：F和R，進行RcAKT1基因全長克隆。引物序列詳見表1。

1.2.2蓖麻RcAKT1基因全長序列的獲取。

蓖麻RcAKT1基因3′末端序列的克隆是參照3′RACE試劑盒的說明書進行的，以蓖麻葉片總RNA為模板，3′RACE Adaptor（來自3′ RACE試劑盒）為反轉(zhuǎn)錄引物獲取cDNA第一條鏈，反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min；70 ℃ 15 min；4 ℃保存。Outer PCR使用引物BMF1和3′ RACE Outer primer（來自3′ RACE試劑盒），反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s；25個循環(huán)，72 ℃ 10 min；4 ℃保存。Inner PCR使用引物BMF2和3′ RACE Inner primer（來自3′ RACE試劑盒），反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s；25個循環(huán)，72 ℃ 10 min；4 ℃保存。蓖麻RcAKT1基因5′末端序列的克隆是參照5′ RACE試劑盒的說明書進行的，以Random 9 mers（來自5′ RACE試劑盒）為反轉(zhuǎn)錄引物獲取cDNA第一條鏈。Outer PCR使用引物BMR1和5′ RACE Outer primer（來自5′ RACE試劑盒），反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s；25個循環(huán)，72 ℃ 10 min；4 ℃保存。Inner PCR使用引物BMR2和5′ RACE Inner primer（來自5′ RACE試劑盒），反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s；25個循環(huán)，72 ℃ 10 min；4 ℃保存。逆轉(zhuǎn)錄使用Oligo dT為引物，反應(yīng)條件：65 ℃ 5 min；42 ℃ 60 min；70 ℃ 5 min；4 ℃保存。目的基因全長克隆使用引物R和F，反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；57 ℃ 40 s；72 ℃ 90 s；30個循環(huán)，72 ℃ 10 min；4 ℃保存。利用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收純化，與PMD18-T連接，重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中，進行氨芐抗性篩選和藍白斑篩選，提取質(zhì)粒，進行質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定，將疑似陽性克隆菌送至北京華大基因測序。

1.2.3蓖麻RcAKT1基因生物信息學(xué)分析。

將經(jīng)過生物公司測序得到的核苷酸序列進行一系列分析，發(fā)現(xiàn)該序列具有完整的開放閱讀框，并確定該開放閱讀框為蓖麻RcAKT1基因cDNA的全長序列。利用NCBI、TMHMM網(wǎng)站以及DNAman、ClustalX、MEGA5.2等生物信息學(xué)軟件對該基因核苷酸序列進行氨基酸序列預(yù)測，分析出該基因的理化性質(zhì)、親水性、疏水性，蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，并將蓖麻與其他幾種植物的AKT1序列進行多重序列比對，觀察序列的一致性。構(gòu)建蓖麻與這幾種植物K+通道蛋白序列系統(tǒng)進化樹。

2結(jié)果與分析

2.1蓖麻RcAKT1基因的全長克隆

將在蓖麻新鮮葉片中提取的總RNA進行0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在電泳圖上顯示出清晰的3條帶，其中第2條帶最亮，第3條帶最暗，充分說明提取的總RNA中蛋白質(zhì)和DNA的污染少、降解量低且豐度較高，表明其質(zhì)量非常好（圖1）。以蓖麻葉片總RNA為模板，設(shè)計引物，利用RACE的方法先后克隆出蓖麻RcAKT1基因的3′末端和5′末端，將經(jīng)公司測序得到的3′末端序列和5′末端序列利用DNAman軟件進行拼接，從而得到目的基因的全長序列[4]，并根據(jù)該全長序列設(shè)計一對特異性引物，進行PCR克隆，電泳圖顯示在2 253 bp處得到一條清晰的條帶，該條帶長度完全符合兩條引物間的序列長度。可確定該PCR產(chǎn)物為目的基因的ORF全長序列（圖2），命名為蓖麻RcAKT1。

2.2蓖麻RcAKT1基因的生物信息學(xué)分析

將獲得的目的基因3′末端與5′末端核苷酸序列利用DNAman軟件進行電子序列拼接，得到RcAKT1基因的ORF全長序列[5]。利用生物信息學(xué)軟件對該基因的核苷酸序列進行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)該序列的開放閱讀框為2 253 bp，推測可不間斷編碼751個氨基酸（圖3），分子量為84.043 ku，等電點（PI）值為6.35，pH=7.0時電荷為-7.52，同時對預(yù)測的RcAKT1氨基酸序列進行了親水性和疏水性分析，在圖中顯示其親水性的平均值為正值，疏水性的平均值為負(fù)值，因而斷定該蛋白為親水性蛋白（圖4）。將RcAKT1基因的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)蓖麻與其他植物該基因的氨基酸序列同源性很高，均為84%～97%（圖5），將與蓖麻親緣關(guān)系較近植物（胡楊、木本棉、葡萄、麻瘋樹、胡桃）的AKT1氨基酸序列，使用DNAman軟件與蓖麻進行多重序列比對，結(jié)果表明其一致性達77.17%（圖6）。利用NCBI網(wǎng)站的Conserved Domains （http：// www.ncbi. Nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb/cgi）預(yù)測RcAKT1基因具有的保守區(qū)域，假定保守域檢測結(jié)果顯示該基因?qū)儆贏NK超級家族，猜測蓖麻RcAKT1基因與這個家族中所包含的其他所有基因具有一樣的功能（圖7）。將基因的氨基酸序列利用網(wǎng)絡(luò)上的服務(wù)器TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)分析，跨膜結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白的氨基酸序列共包含了5個跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，由此推斷蓖麻RcAKT1為跨膜蛋白，并且該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)全部集中在N端，而C端不含跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)（圖8）。

3結(jié)論與討論

內(nèi)整流K+通道蛋白基因在植物的抗逆方面起到非常重要的作用，該試驗利用RACE法克隆出蓖麻RcAKT1基因的cDNA全長序列，該序列長度為2 253 bp，推測可不間斷編碼751個氨基酸。選取其他植物的內(nèi)整流K+通道蛋白序列與蓖麻的AKT1序列進行比對，結(jié)果顯示同源性很高，其一致性在84%～97%。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)蓖麻絲氨酸/蘇氨酸激酶屬于ANK超級家族，是親水性蛋白質(zhì)。

通過對RcAKT1基因序列的生物信息學(xué)分析，在分子水平預(yù)測其結(jié)構(gòu)與功能特性，可以更好地掌握它的作用機制，也為研究其他與抗逆相關(guān)的基因奠定了堅實的基礎(chǔ)。植物的抗逆是一個十分復(fù)雜的過程，是由植物體內(nèi)多個基因相互

協(xié)調(diào)作用的結(jié)果[6]，為進一步研究蓖麻的抗逆過程，首先要在蓖麻體內(nèi)克隆出所有與抗逆相關(guān)的基因，并探索出這些基因的相互作用機制，今后可以利用轉(zhuǎn)基因的手段，將這些抗

逆基因轉(zhuǎn)入到其他抗逆性差的植物體內(nèi)，有望在提高植物的

抗逆性方面取得重要突破，為農(nóng)作物生產(chǎn)和應(yīng)用做出貢獻。同時，還可以采取分子生物學(xué)的一些方法研究該基因，并進一步轉(zhuǎn)化到蓖麻植株內(nèi)，以培育出抗逆效果更加顯著的蓖麻新品種。

參考文獻

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