小黃花石斛的無菌播種與快速繁殖

李宏楊+劉揚+陳冠銘+楊志娟

摘 要 為保護與利用小黃花石斛野生資源，采用種子無菌播種、試驗不同培養(yǎng)基、不同激素配比以及添加天然有機復(fù)合物等方法，探究小黃花石斛的組培快繁技術(shù)。研究結(jié)果表明：小黃花石斛種子在1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后形成原球莖團，萌發(fā)率超過80%，再培養(yǎng)30 d后出芽整齊；單芽轉(zhuǎn)接到MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+土豆粉100 g/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d后形成叢生芽，增殖系數(shù)達到8.58；幼苗轉(zhuǎn)接到MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L+香蕉粉100 g/L+CA 1.0 g/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)80 d后可形成完整植株，小苗移栽60 d后，成活率達到71.45%。

關(guān)鍵詞 小黃花石斛 ；無菌播種 ；組織培養(yǎng) ；快速繁殖

中圖分類號 S567.23 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.05.005

Aseptic Seeding and Rapid Propagation of Dendrobium jenkinsii

LI Hongyang LIU Yang CHEN Guanming YANG Zhijuan

（Sanya Science &Technology Academy of Crop Winter Multiplication， Sanya， Hainan 572000）

Abstract In order to protect and utilize the wild plant resources of Dendrobium jenkinsii， the techniques of tissue culture and rapid propagation of D. jenkinsii were explored by using aseptic seed sowing， different media， different hormone ratio and natural organic compound. The results showed that the seeds of D. jenkinsii formed protocorms 10 days after cultured in 1/2MS medium with a germination rate of more than 80% and were all germinated after another 30 days. Each single bud was transferred to a culture medium containing MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+potato powder 100 g/L and produced clusters 60 days after cultured， and the multiplication coefficient was upto 8.58. The plantlets derived from the clusters were transferred to a medium containing MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L+banana powder 100 g/L+activated carbon 1.0 g/L and formed strong rooted plants 80 d after cultured. The rooted plants had a survival rate of 71.45% 60 days after transplanted.

Keywords Dendrobium jenkinsii ； aseptic seeding； tissue culture ； rapid propagation

小黃花石斛（Dendrobium jenkinsii）與聚石斛十分相似，植物體各部分較小，莖長1～2.5 cm，具4個棱，葉橢圓形，總狀花序，具1～3朵黃花。小黃花石斛常生于海拔700～1 300 m的疏林中，鱗片狀附生于樹干或石頭上，分布于錫金、不丹、印度東北部、緬甸、泰國、老撾等地及我國云南南部[1]。《中國植物志》上將小黃花石斛和鼓槌石斛、密花石斛、聚石斛、具槽石斛、球花石斛聚為一組，而現(xiàn)代分子生物學的研究結(jié)果與形態(tài)分類不一致。武榮花[2]采用石斛葉綠體DNA trnL-trnF間隔區(qū)序列比較和采用ISSR分子標記對我國的部分石斛屬植物資源進行親緣關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，小黃花石斛自成一組，與翅梗石斛親緣關(guān)系較近。金劍峰等[3]對24種石斛屬植物的rDNA ITS序列進行克隆分析，小黃花石斛和景洪石斛、劍葉石斛、球花石斛、短棒石斛聚為一組。小黃花石斛屬于矮小型原生種，花色奪目，形態(tài)高雅，是熱帶石斛蘭矮化育種的優(yōu)良親本，可通過屬內(nèi)雜交或參考親緣關(guān)系分類培育新品種，但有關(guān)研究報道很少，至今未見品種登錄（RHS）。小黃花石斛自然結(jié)實率高，但和其它蘭科植物一樣，種子萌發(fā)率極低，主要靠無性繁殖連片生長。近年來，小黃花石斛野生資源受人類掠奪性盜采，公開售賣，已瀕臨滅絕。因此，有必要研究小黃花石斛的離體快繁育苗技術(shù)，為其資源保存與開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

小黃花石斛（Dendrobium jenkinsii Lindl.）為云南野生種，保存于三亞市南繁科學技術(shù)研究院石斛資源圃，人工異花授粉后其蒴果在140 d左右開始變黃成熟，采摘備用。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

將小黃花石斛蒴果經(jīng)自來水洗凈，用75%酒精浸泡消毒20 s，0.1%升汞溶液消毒15 min，無菌水沖洗6次。風干水分，切開蒴果，將種子均勻散落到培養(yǎng)基上。

1.2.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

種子萌發(fā)培養(yǎng)基：（1） MS；（2） 1/2 MS（大量元素減半）；（3） 1/2 MS+土豆粉80 g/L。叢生芽增殖培養(yǎng)基：（4） MS+KT 0.5～1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+土豆粉100 g/L。壯苗生根培養(yǎng)基：（5） MS+NAA 0.5 mg/L+CA（活性炭）1.0 g/L；（6） MS+NAA 0.5 mg/L+土豆粉100 g/L+CA 1.0 g/L；（7） MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L+土豆粉100 g/L+CA 1.0 g/L；（8） MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L+香蕉粉100 g/L+CA 1.0 g/L。以上培養(yǎng)基均添加蔗糖25 g/L，卡拉膠7 g/L，pH調(diào)為 5.8，培養(yǎng)溫度25℃，光照強度1 500～2 000 lx，光照時間每天12 h。

1.2.3 種子萌發(fā)培養(yǎng)

將種子播種到培養(yǎng)基（1）～（4）上，每個培養(yǎng)基接種10瓶，每天觀察種子萌發(fā)情況，記錄初始萌發(fā)時間（原球莖開始出現(xiàn)的時間），觀察記錄萌發(fā)率。

1.2.4 叢生芽增殖培養(yǎng)

待原球莖出芽后，切取長勢基本一致的單芽轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基（5）上，每個處理接種15瓶，每瓶接種5個。持續(xù)觀察叢生芽生長情況，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計增殖率，每瓶叢生芽增殖系數(shù)=出芽數(shù)/5。

1.2.5 壯苗與生根培養(yǎng)

選取0.5 cm左右的單芽（幼苗），轉(zhuǎn)接到壯苗與生根培養(yǎng)基（6）～（8）上，每個處理接種20瓶，每瓶轉(zhuǎn)接6株。轉(zhuǎn)接后持續(xù)觀察小苗的生長發(fā)育狀況，80 d后抽樣統(tǒng)計小苗的莖長、莖粗、根數(shù)、根長、葉片等指標。

1.2.6 煉苗移栽

將培養(yǎng)瓶放置于蘭花設(shè)施大棚內(nèi)，1周后取出生根苗，洗凈培養(yǎng)基，用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡10 min，取出晾干。挑選大小基本一致的小苗種植于水苔基質(zhì)中，并噴灑1 000倍的多菌靈消毒液，置于陰涼通風處培養(yǎng)，保持基質(zhì)濕度，60 d后統(tǒng)計小苗的存活率。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對種子萌發(fā)的影響

小黃花石斛種子在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)很少且時間長，30 d后基本褐化死亡。在1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā)時間最快，萌發(fā)率最高，原球莖長勢好，培養(yǎng)7 d即有種子由黃轉(zhuǎn)綠，20 d后大多數(shù)原球莖變綠出芽，40 d后可轉(zhuǎn)接增殖培養(yǎng)。在添加了土豆粉的1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率也較高，但萌發(fā)時間較長，原球莖生長慢且弱小，不利于增殖培養(yǎng)。

2.2 不同激素濃度配比對增殖培養(yǎng)的影響

將單芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，30 d后即形成明顯的叢生芽，可切分叢芽增殖。結(jié)果見表2，以MS為基本培養(yǎng)基，如不添加NAA，嫩芽大部分死亡。在添加了NAA 0.2 mg/L的前提下，隨著細胞分裂素KT濃度的增加，小芽的增殖系數(shù)增加，但KT的濃度提高到1.5 mg/L時增殖系數(shù)不再增加。KT 0.5 mg/L與NAA組合中，NAA起主導(dǎo)作用，增殖的叢生芽表現(xiàn)為根多芽小，芽細長，葉小；KT 1.5 mg/L與NAA組合中，KT則抑制了小芽的生長，增殖的叢生芽較矮小、生長緩慢。KT 1.0 mg/L與NAA組合的增殖系數(shù)達到8.58，叢生芽的單芽較為粗壯，且有根發(fā)生，有利于繼代培養(yǎng)或生根壯苗培養(yǎng)。

2.3 不同培養(yǎng)基對壯苗與生根培養(yǎng)的影響

叢生芽經(jīng)分化生長培養(yǎng)即可單苗轉(zhuǎn)接進行壯苗與生根培養(yǎng)，以MS為基本培養(yǎng)基，研究了生長素和天然有機復(fù)合物對幼苗生長的影響，并統(tǒng)計了幼苗移栽成活率（表3）。第4種培養(yǎng)基中添加了NAA、低濃度的IBA和香蕉粉汁，培養(yǎng)效果最好，幼苗生根數(shù)最多，移栽成活率達到71.45%，根長、莖長和莖粗均表現(xiàn)優(yōu)異。研究發(fā)現(xiàn)，所有幼苗均在莖的頂端著生2個葉片，而且不同培養(yǎng)基對幼苗莖長的影響不大；幼苗雖然植株矮小，生長慢，但根系發(fā)達，生根多，根系長，一般成苗時已布滿整個培養(yǎng)基，這是由小黃花石斛的遺傳特性決定的。

3 討論

培養(yǎng)基中的無機營養(yǎng)成分（大量元素和微量元素）是植物生長必須的，而植物不同發(fā)育階段對元素的種類和需求量各不相同。1/2 MS培養(yǎng)基可使小黃花石斛種子提早萌發(fā)并提高萌發(fā)率，可見較低的無機營養(yǎng)成分更適合石斛種子初期的生長發(fā)育，同樣的研究結(jié)果出現(xiàn)在石斛屬其它植物的組織培養(yǎng)中，如金釵石斛[4]、鐵皮石斛[5]。

激素對植物組培快繁起著至關(guān)重要的作用，組織培養(yǎng)中的技術(shù)難點之一就是控制各種激素在培養(yǎng)基中的濃度。控制所添加的細胞分裂素和生長素的濃度，可以控制芽或根的分化，細胞分裂素/生長素的比值大時有利于芽的形成，比值小時則有利于生根[6]。本研究結(jié)果也證實了上述觀點，增殖培養(yǎng)中NAA 0.2 mg/L濃度保持不變，KT濃度在0.5 mg/L時芽少根多，NAA濃度在1.0 mg/L時顯著提高了增殖率，達到最大的8.58倍，而KT濃度提高到1.5 mg/L時則抑制芽的生長。在壯苗與生根培養(yǎng)時，向NAA 0.5 mg/L +土豆粉100 g/L培養(yǎng)基中添加低濃度的IBA 0.05 mg/L，幼苗的莖粗即顯著增大，移栽成活率大幅提高，說明2種生長素配合使用比單一激素效果要好。

在蘭科植物的組織培養(yǎng)時，常用到椰乳、香蕉粉、土豆粉等天然有機復(fù)合物，其主要作用可能是為植物生長提供某些生理活性物質(zhì)或補充某些未知的微量成分，而在不同培養(yǎng)階段，則表現(xiàn)為促進或抑制生長效果[7-11]。試驗研究表明，土豆粉明顯抑制了種子萌發(fā)生長，種子萌發(fā)變慢且發(fā)芽較少，這可能是土豆粉中含有的植物激素、酶、無機鹽等某種成分干擾了其正常發(fā)育過程。土豆粉對根系誘導(dǎo)與壯苗沒有明顯的促進效果，香蕉粉比土豆粉更好誘導(dǎo)生根，幼苗健壯，利于移栽成活，移栽成活率達到71.45%。有研究表明，香蕉粉提取物可促進植株根系發(fā)達，促進莖葉生長；能促進試管苗酶的活性，有效增強幼苗的抗逆性；還對維持培養(yǎng)基的pH值有緩沖作用[12]。本研究初步建立了小黃花石斛組培快繁技術(shù)，但該物種株小苗弱，組培苗移栽成活率偏低，叢生芽增殖、分化及生根壯苗階段，還有待進一步研究。

綜上，本研究以小黃花石斛的種子為外植體，種子萌發(fā)誘導(dǎo)、叢生芽增殖、壯苗與生根培養(yǎng)， 形成完整植株，經(jīng)煉苗移栽后，得到表型一致的健壯種苗。本技術(shù)具有操作簡單、污染率低、繁殖系數(shù)高等優(yōu)點，可應(yīng)用于種質(zhì)資源保存、遺傳育種及規(guī)模化育苗等。

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