基于菌藻對(duì)比培養(yǎng)方法的洱海沉積物溶解性有機(jī)氮生物有效性評(píng)價(jià)

許可宸, 張 莉, 王圣瑞*, 王曙光, 錢(qián)偉斌, 李文章, 史玲瓏

1.北京化工大學(xué)， 北京 100029 2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院， 環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100012 3.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院， 國(guó)家環(huán)境保護(hù)湖泊污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖泊生態(tài)環(huán)境創(chuàng)新基地， 北京 100012

基于菌藻對(duì)比培養(yǎng)方法的洱海沉積物溶解性有機(jī)氮生物有效性評(píng)價(jià)

許可宸1,2,3, 張 莉2,3, 王圣瑞2,3*, 王曙光1, 錢(qián)偉斌2,3, 李文章2,3, 史玲瓏2,3

1.北京化工大學(xué)， 北京 100029 2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院， 環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100012 3.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院， 國(guó)家環(huán)境保護(hù)湖泊污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖泊生態(tài)環(huán)境創(chuàng)新基地， 北京 100012

為了深入探究DON(溶解性有機(jī)氮)在湖泊水生生態(tài)系統(tǒng)中的重要營(yíng)養(yǎng)作用和生態(tài)效應(yīng)，尋找科學(xué)的DON生物有效性評(píng)價(jià)方法，選擇洱海不同湖區(qū)表層沉積物樣品，通過(guò)室內(nèi)接種細(xì)菌和銅綠微囊藻進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)，運(yùn)用三維熒光-平行醫(yī)療法(3D EEM-PARAFAC)研究菌藻對(duì)比培養(yǎng)條件下湖泊沉積物DON生物有效性及各DON熒光組分生物有效性差異. 結(jié)果表明：①藻類培養(yǎng)條件下洱海表層沉積物DON生物有效性(8.49%～42.5%)略低于細(xì)菌培養(yǎng)條件下的生物有效性(10.5%～45.3%). ②藻培養(yǎng)條件下，DON生物利用率與藻細(xì)胞密度增長(zhǎng)量呈顯著正相關(guān)，即藻細(xì)胞密度的增長(zhǎng)量可作為反映沉積物DON生物有效性的指標(biāo). ③菌類培養(yǎng)過(guò)程中DON光譜學(xué)特征參數(shù)〔如SUVA254(254 nm處紫外吸收光譜系數(shù))、SR(275～295 nm處吸收光譜系數(shù)與350～400 nm處吸收光譜系數(shù)比值)等〕與DON含量相關(guān)性總體較細(xì)菌培養(yǎng)好；培養(yǎng)液中SUVA254有不同程度下降，SR指數(shù)均有上升，大分子DON和高芳香性DON可被微生物降解. 相比于陸源熒光組分，內(nèi)源熒光組分的生物有效性較差. ④相比而言，藻類培養(yǎng)方法能更直觀地反映沉積物DON對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響，可在一定程度上作為衡量湖泊沉積物DON生物有效性的指標(biāo)，即藻類培養(yǎng)方法更適合評(píng)價(jià)洱海沉積物DON生物有效性.

溶解性有機(jī)氮； 沉積物； 生物有效性； 菌藻對(duì)比培養(yǎng)； EEM-PARAFAC

DON(溶解性有機(jī)氮)是湖泊沉積物氮的重要組成部分[1]，對(duì)湖泊富營(yíng)養(yǎng)化具有重要影響[2]. DON生物有效性是指生物對(duì)DON的可利用程度，可用DON的可利用量占DON總量的百分比來(lái)表示[3]. 因此，認(rèn)識(shí)、評(píng)價(jià)湖泊沉積物DON生物有效性，是評(píng)估沉積物內(nèi)負(fù)荷對(duì)湖泊富營(yíng)養(yǎng)化貢獻(xiàn)的重要內(nèi)容之一. 目前關(guān)于水體DON的生物有效性已有大量報(bào)道，但沉積物DON生物有效性的研究尚處于起步階段[4-5]. 與上覆水相比，沉積物成分復(fù)雜，且沉積環(huán)境千差萬(wàn)別，目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的生物有效性評(píng)價(jià)方法. 生物培養(yǎng)法由于其具有直觀且可量度等優(yōu)點(diǎn)，是常被用來(lái)評(píng)價(jià)某一物質(zhì)生物有效性的方法. 目前關(guān)于DON生物有效性的研究多采用接種微生物和淡水藻類的方法評(píng)價(jià)DON生物有效性[6]，而對(duì)于兩種評(píng)價(jià)方法的效果及差異方面的研究較為缺乏.

通過(guò)PARAFAC(平行因子分析法)來(lái)解析三維熒光光譜的組分最初是由Stedmon等[7]提出并應(yīng)用到自然界DOM(溶解性有機(jī)物)的研究中. 之后國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者應(yīng)用該方法研究水體以及沉積物中DOM的三維熒光光譜特征. YAO等[8-9]利用EEM-PARAFAC手段對(duì)鄱陽(yáng)湖以及太湖的水體中DOM的來(lái)源及演變進(jìn)行了解析；Osburn等[10]利用該方法研究Neuse River Estuary區(qū)域風(fēng)暴前后DOM的變化情況. 相比傳統(tǒng)的熒光峰分類方法，PARAFAC可以更準(zhǔn)確的確定樣本中DOM的種類、來(lái)源等性質(zhì). DON作為DOM的重要組成部分，成分非常復(fù)雜，傳統(tǒng)的研究手段只能定義DON中約30%的成分[11]. 熒光光譜法之所以能夠?qū)χ拔炊x的DON成分進(jìn)行分析，是因?yàn)榇蟛糠值腄ON會(huì)和腐殖質(zhì)物質(zhì)或類蛋白物質(zhì)結(jié)合在一起[12]. 已經(jīng)有大量研究[13-15]利用熒光光譜法這種簡(jiǎn)單高效的手段對(duì)DON進(jìn)行全面分析，并廣泛應(yīng)用對(duì)DON的結(jié)構(gòu)及來(lái)源研究中. 該研究中利用熒光光譜結(jié)合PARAFAC法，對(duì)不同的菌藻比對(duì)培養(yǎng)階段提取的樣本中的DON組分進(jìn)行表征分析，探究不同組分的種類、來(lái)源以及它們?cè)谂囵B(yǎng)過(guò)程中的變化情況.

洱海位于中國(guó)云南西部大理白族自治州境內(nèi)(25°25′N(xiāo)～26°16′N(xiāo)、99°32′E～100°27′E)，地處瀾滄江、金沙江和元江三大水系分水嶺地帶，流域面積2 565 km2，是云貴高原第二大淡水湖. 洱海水質(zhì)介于GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》要求的Ⅱ類水質(zhì)到Ⅲ類水質(zhì)之間，但沉積物氮磷污染嚴(yán)重，其w(TN)為2 354～6 174 mgkg，并且不同湖區(qū)差異較大[16]. 程杰等[17]研究發(fā)現(xiàn)洱海南部水深較淺，有水生植物分布；中部處于環(huán)流下緣，水深較深，無(wú)水生植物；北部是入湖口，沉水植物豐富，受農(nóng)業(yè)面源污染影響較為嚴(yán)重.洱海沉積物DON主要由大分子物質(zhì)組成，芳香性及腐殖化程度相對(duì)較高，對(duì)維持洱海較好水質(zhì)具有一定的積極作用. 但近年來(lái)洱海營(yíng)養(yǎng)鹽含量不斷升高，沉積物內(nèi)源釋放對(duì)水體ρ(TN)的影響加劇[16]. 因此，為深入評(píng)估洱海沉積物DON對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化的貢獻(xiàn)，有必要通過(guò)接種微生物培養(yǎng)定量分析洱海沉積物DON生物有效性.

該研究擬通過(guò)室內(nèi)接種細(xì)菌和接種銅綠微囊藻，對(duì)比研究?jī)煞N培養(yǎng)條件下沉積物DON降解利用差異，通過(guò)三維熒光光譜和紫外-可見(jiàn)光吸收光譜兩種手段結(jié)合平行因子法，綜合表征培養(yǎng)過(guò)程中沉積物DON結(jié)構(gòu)變化特征，以期深入理解DON在湖泊水生生態(tài)系統(tǒng)中重要營(yíng)養(yǎng)作用和生態(tài)效應(yīng)，為進(jìn)一步揭示洱海富營(yíng)養(yǎng)化機(jī)理提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況及樣品采集

根據(jù)洱海地理位置、湖底地形及環(huán)境條件，將其分為北、中、南三個(gè)湖區(qū)(見(jiàn)圖1)，選取表層沉積物為研究對(duì)象，即北部46#采樣點(diǎn)、中部105#采樣點(diǎn)、南部142#采樣點(diǎn)，具體位置見(jiàn)圖1. 142#采樣點(diǎn)w(DOC)(DOC為溶解性有機(jī)碳)和w(DON)為最高，分別達(dá)670.5和59.1 mgkg，46#采樣點(diǎn)次之，其值分別為602.3和53.3 mgkg，二者的w(TDN)(TDN為總?cè)芙庑缘?基本持平(123.0～124.0 mgkg). 105#采樣點(diǎn)的基本理化指標(biāo)為最低，w(DOC)、w(TDN)和w(DON)分別為395.9、85.8和30.8 mgkg. 于2014年9月利用彼得森采泥器采集表層(0～10 cm)沉積物樣品，將采集的樣品現(xiàn)場(chǎng)裝入塑料袋中密封，在恒溫箱中4 ℃下避光保存，部分沉積物鮮樣帶回實(shí)驗(yàn)室經(jīng)冷凍干燥、研磨、過(guò)150 μm篩、并用超高壓滅菌技術(shù)[18]再次滅菌后用于配備生物培養(yǎng)液. 另取部分沉積物鮮泥用于細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn).

注：圖中數(shù)值代表水深，單位為m.圖1 洱海沉積物采樣點(diǎn)Fig.1 Sediment sampling sites in Erhai Lake

1.2 研究方法

1.2.1ρ(DOC)、ρ(DON)的測(cè)定

將過(guò)篩沉積物樣品與無(wú)菌Milli-Q超純水按V(水)∶V(土)為10∶1的比例充分混合后，置于恒溫?fù)u床中在20 ℃、220 rmin條件下振蕩16 h，以10 000 rmin離心10 min，上清液過(guò)玻璃纖維濾膜(GFF，Whatman，450 ℃下灼燒4 h)，一部分濾液用于DON培養(yǎng)試驗(yàn)，一部分用于測(cè)定ρ(TDN)、ρ(NH4+-N)與ρ(NO3-N)，分別采用文獻(xiàn)[19]中的堿性過(guò)硫酸鉀氧化法、納氏試劑分光光度法和鹽酸-氨基磺酸紫外分光光度法測(cè)定.ρ(DON)為ρ(TDN)與ρ(溶解性無(wú)機(jī)氮)〔ρ(NH4-N)與ρ(NO3-N)之和〕的差值.ρ(DOC) 采用TOC分析儀(Shimadzu，Japan)高溫催化氧化法測(cè)定.

1.2.2 光譜結(jié)構(gòu)測(cè)定

紫外吸收特征使用Agilent 8453紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó))分析，光譜采集范圍為200～700 nm，掃描間隔為1 nm，使用1 cm石英比色皿在室溫下完成紫外-可見(jiàn)光譜的采集. 在254、280 nm處分別測(cè)定各溶液的吸光度值(分別記為SUVA254、SUVA280)，分別計(jì)算SUVA254值和SUVA280值.

三維熒光光譜(3DEEM)采用Hitachi F-7000型熒光光譜分析儀測(cè)定，λEx(激發(fā)波長(zhǎng))范圍為200～450 nm，λEm(發(fā)射波長(zhǎng))范圍為250～600 nm，λEx和λEm的帶寬均為5 nm，掃描速率為2 400 nmmin，響應(yīng)時(shí)間為“自動(dòng)”，掃描光譜進(jìn)行儀器自動(dòng)校正，室溫下使用1 cm石英熒光樣品吸收池完成三維熒光光譜的采集.

1.3 試驗(yàn)處理

細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)所用的細(xì)菌接種液：將各采樣點(diǎn)對(duì)應(yīng)的沉積物鮮樣置于離心管以V(水)∶V(土)為10∶1的比例加入無(wú)菌水，在20 ℃、200 rmin下恒溫振蕩1 h，沉積物-水溶液為細(xì)菌接種液.

藻培養(yǎng)試驗(yàn)使用的藻：產(chǎn)毒的單細(xì)胞銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)，由中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院湖泊生態(tài)環(huán)境創(chuàng)新基地藻種庫(kù)提供，在人工氣候室中培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期后用于接種.

培養(yǎng)條件與取樣：取100 mL濾液置于150 mL錐形瓶中，作為生物培養(yǎng)基，分別以1%和2.5%體積比接入細(xì)菌接種液和微囊藻，設(shè)2組平行和1組空白. 將接種后的微生物培養(yǎng)液放置于人工氣候室中在(25±1)℃避光培養(yǎng). 接種后的藻培養(yǎng)液放置于人工氣候室中，光照強(qiáng)度為3 000 lx；明暗周期12 h∶12 h；溫度(25±1)℃. 試驗(yàn)中使用的所有玻璃儀器經(jīng)HCl浸泡24 h，洗凈后高溫滅菌(121 ℃，1 h). 分別在0、2、4、7、10、14、19、25 d取樣，測(cè)定ρ(DON)和ρ(DOC). 另取藻培養(yǎng)液，利用血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察微囊藻生長(zhǎng)情況[20-21].

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)圖表繪制采用Origin 9.0，數(shù)據(jù)處理采用Excel 2016和SPSS 17.0進(jìn)行. 關(guān)于DON的三維熒光光譜平行因子分析，每個(gè)培養(yǎng)階段的菌藻試驗(yàn)樣品分別取多次平行樣，通過(guò)熒光測(cè)樣得到熒光矩陣分別組合，構(gòu)成一個(gè)新的多維矩陣組. 運(yùn)用Matlab 2010a PARAFAC工具箱對(duì)于這個(gè)矩陣組進(jìn)行平行因子處理，整個(gè)分析過(guò)程包括扣除空白、去除瑞利和拉曼散射、平行因子分析、繪制等高線及其相應(yīng)的平行因子圖譜. 根據(jù)處理后的核一致性結(jié)果，選擇需要因子個(gè)數(shù). 由于試驗(yàn)時(shí)間跨度較長(zhǎng)，不同樣本取樣時(shí)間有差異，熒光強(qiáng)度的測(cè)定結(jié)果因熒光機(jī)器的狀態(tài)差異會(huì)有不同的機(jī)器誤差，為消除這種誤差，每次測(cè)樣的同時(shí)配置硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液，在λExλEm為350 nm450 nm的條件下測(cè)定得到其最大熒光強(qiáng)度，最終樣品的熒光強(qiáng)度由測(cè)定強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)硫酸奎寧溶液的最大熒光強(qiáng)度比值(QSU)來(lái)表示. 試驗(yàn)最終確定組分，并且得到各樣品的濃度矩陣、最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)，以及各個(gè)組分熒光強(qiáng)度.

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌與藻類培養(yǎng)條件下洱海沉積物ρ(DON)變化特征

2.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)條件下ρ(DON)變化特征

由圖2可見(jiàn)，46#采樣點(diǎn)沉積物ρ(DON)在培養(yǎng)前4 d顯著下降，在后6 d有所上升，后期持續(xù)下降. 142#采樣點(diǎn)沉積物DON降解變幅較大，總體呈下降趨勢(shì). 與其他采樣點(diǎn)不同，105#采樣點(diǎn)沉積物ρ(DON) 在培養(yǎng)的前期呈波動(dòng)上升趨勢(shì)，在培養(yǎng)的第10天達(dá)到峰值后持續(xù)降低. 3個(gè)采樣點(diǎn)對(duì)應(yīng)的DON最佳降解時(shí)間為培養(yǎng)的第19天.

圖2 細(xì)菌培養(yǎng)條件下沉積物ρ(DON)的變化Fig.2 DON content variation under bacterial incubation

2.1.2 藻培養(yǎng)條件下ρ(DON)變化及藻密度變化特征

由圖3可見(jiàn)，藻培養(yǎng)條件下，46#采樣點(diǎn)142#采樣點(diǎn)沉積物ρ(DON)呈直線趨勢(shì)下降，在培養(yǎng)的第14天降解量接近最大，并在之后的培養(yǎng)過(guò)程中逐漸穩(wěn)定于3.88和3.83 mgL. 而105#采樣點(diǎn)沉積物DON在培養(yǎng)的第7天接近降解的峰值，并在之后的培養(yǎng)過(guò)程中逐漸穩(wěn)定于2.59 mgL. 46#和105#采樣點(diǎn)沉積物DON均在培養(yǎng)的第2天達(dá)到最大降解速率，分別為0.137和0.048 mg(L·d)，142#采樣點(diǎn)沉積物DON在培養(yǎng)的第4天達(dá)到最大降解速率，為0.240 mg(L·d).

圖3 藻培養(yǎng)條件下沉積物ρ(DON)與藻密度的變化Fig.3 Variation of DON content and algae density under algae incubation

藻類生長(zhǎng)呈“S”型曲線上升趨勢(shì)，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，46#采樣點(diǎn)藻密度增至7.13×106mL-1，與DON降解情況不同，105#采樣點(diǎn)藻密度增至4.70×106mL-1，低于46#采樣點(diǎn). 142#采樣點(diǎn)藻生長(zhǎng)相對(duì)平緩，在培養(yǎng)第14天基本達(dá)到生長(zhǎng)的平臺(tái)期，到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，藻密度為6.98×106mL-1.

2.2 基于細(xì)菌與藻類培養(yǎng)條件下洱海沉積物DON結(jié)構(gòu)特征

2.2.1 細(xì)菌、藻類培養(yǎng)過(guò)程中沉積物DON三維熒光光譜變化特征

以105#采樣點(diǎn)為例，湖泊沉積物初始培養(yǎng)液EEM-PARAFAC組分如圖4～6所示，分析得到3種熒光組分. 根據(jù)各組分的激發(fā)發(fā)射峰波長(zhǎng)可以判斷其余2個(gè)采樣點(diǎn)樣本中所含有的為相同的3種DON熒光組分(見(jiàn)表1)，分別為一種陸源類腐殖質(zhì)物質(zhì)(命名為S1)、內(nèi)源類色氨酸物質(zhì)(命名為S2)，以及另一種陸源類腐殖質(zhì)物質(zhì)(命名為S3). 同樣以105#采樣點(diǎn)為例，對(duì)應(yīng)的S1、S2和S3熒光組分，總體的熒光強(qiáng)度呈先增強(qiáng)后下降的趨勢(shì)，并且細(xì)菌培養(yǎng)液中各組分熒光峰強(qiáng)拐點(diǎn)均出現(xiàn)在7～10 d之間，而藻類培養(yǎng)液中則出現(xiàn)在4～7 d(見(jiàn)表2). 其余各采樣點(diǎn)的各組分熒光強(qiáng)度變化呈現(xiàn)相同的特性，但處于北部湖區(qū)的46#采樣點(diǎn)和南部湖區(qū)的142#采樣點(diǎn)外源組分S1、S3的初始熒光強(qiáng)度(46#采樣點(diǎn)分別為3.084、4.204 QSU，142#采樣點(diǎn)分別為3.338和4.676 QSU)明顯強(qiáng)于中部湖區(qū)(105#采樣點(diǎn)中該2種組分的熒光強(qiáng)度).

表1 菌藻培養(yǎng)前各熒光組分特性

表2 菌藻培養(yǎng)過(guò)程中PARAFAC組分熒光強(qiáng)度(QSU)變化特征

圖4 105#采樣點(diǎn)初始EEM-PARAFAC組分Fig.4 EEM-PARAFAC components of 105# before incubation

2.2.2 細(xì)菌、藻類培養(yǎng)過(guò)程中沉積物DON紫外-可見(jiàn)光吸收光譜變化特征

DON存在多種含氮官能團(tuán)，通過(guò)全波長(zhǎng)紫外掃描可以表征其官能團(tuán)結(jié)構(gòu). SUVA254可以間接用于反映腐殖質(zhì)的芳香性，其值越大則芳香性越大[22]. ZHANG等[11]研究指出，SR指數(shù)與溶解性有機(jī)物平均分子量具有顯著負(fù)相關(guān)性，并且當(dāng)SR>1時(shí)沉積物中DON組分以內(nèi)源組分為主，SR<1時(shí)以外源組分為主.

圖5 105#采樣點(diǎn)位菌類培養(yǎng)至第14天EEM-PARAFAC組分Fig.5 EEM-PARAFAC components of 105# on day 14 under incubation by bacteria

圖6 105#采樣點(diǎn)位藻類培養(yǎng)至第14天EEM-PARAFAC組分Fig.6 EEM-PARAFAC components of 105# on day 14 under incubation by algae

如圖7所示，藻培養(yǎng)過(guò)程中46#采樣點(diǎn)和142#采樣點(diǎn)培養(yǎng)液SUVA254指數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)而下降，并且46#采樣點(diǎn)培養(yǎng)液SUVA254指數(shù)下降趨勢(shì)較142#采樣點(diǎn)顯著，105#采樣點(diǎn)培養(yǎng)液SUVA254指數(shù)變化并不明顯. 而在細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)中，3個(gè)采樣點(diǎn)培養(yǎng)液SUVA254指數(shù)均呈下降趨勢(shì)，并且降幅大于藻培養(yǎng)條件下；3個(gè)采樣點(diǎn)菌藻培養(yǎng)過(guò)程中SR指數(shù)均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì). 菌類培養(yǎng)在0～7 d保持快速增長(zhǎng)，10 d之后增長(zhǎng)速度減緩，藻類培養(yǎng)0～4 d 保持快速增長(zhǎng)7 d以后增長(zhǎng)速度減緩. 趨于穩(wěn)定之后，藻類培養(yǎng)液SR值高于菌類培養(yǎng)液SR值.

圖7 細(xì)菌、藻培養(yǎng)條件下SUVA254指數(shù)和SR指數(shù)的變化Fig.7 Changes of SUVA254 and SR value during incubation by bacteria and algae

3 討論

3.1 細(xì)菌、藻類對(duì)比培養(yǎng)下洱海沉積物DON生物有效性

細(xì)菌和藻類培養(yǎng)條件下三個(gè)采樣點(diǎn)沉積物ρ(DON) 均呈下降趨勢(shì)，其生物有效性依次為142#采樣點(diǎn)>105#采樣點(diǎn)>46#采樣點(diǎn)(見(jiàn)表3). 究其原因，主要與3個(gè)采樣點(diǎn)所在湖區(qū)環(huán)境特征有關(guān). 46#采樣點(diǎn)和142#采樣點(diǎn)分別位于入湖河口和人類活動(dòng)頻繁區(qū)域，受外源污染嚴(yán)重，其可被微生物利用的ρ(DON) 較大，生物有效性較高. 105#采樣點(diǎn)位于全湖中部區(qū)域，水體較深，外源污染對(duì)其影響較小，不利于沉積物積累高生物有效性的DON，沉積物DON生物有效性較低. 該研究中，細(xì)菌培養(yǎng)條件下，由于生物固氮作用較強(qiáng)[23]，ρ(DON)呈波動(dòng)變化. 同時(shí)，試驗(yàn)是在有氧環(huán)境下進(jìn)行，適宜硝化菌等好氧菌的生長(zhǎng)，對(duì)沉積物DON降解能力較藻類強(qiáng)，這就導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)條件下的DON生物有效性高于藻培養(yǎng)條件下的生物有效性，且達(dá)到最佳降解時(shí)間較長(zhǎng). DON對(duì)藻類生長(zhǎng)具有直接或間接的作用[24]，藻培養(yǎng)條件下，DON下降的量〔Δ(DON)〕與藻細(xì)胞密度的增長(zhǎng)量呈顯著正相關(guān)(見(jiàn)表4)，說(shuō)明藻類在生長(zhǎng)過(guò)程中消耗可利用的DON，DON除滿足藻類自身生長(zhǎng)需要外，還促進(jìn)其分裂繁殖，同時(shí)，藻細(xì)胞密度提高會(huì)促進(jìn)DON消耗，因此藻類生長(zhǎng)的同時(shí)伴隨著ρ(DON)的下降，藻細(xì)胞密度增長(zhǎng)量能反映DON的降解情況.

表3 洱海表層沉積物DON生物有效性及生物可利用量

3.2 菌藻培養(yǎng)對(duì)洱海沉積物DON結(jié)構(gòu)的影響

3個(gè)采樣點(diǎn)初始培養(yǎng)液的EEM-PARAFAC組分峰強(qiáng)和紫外-可見(jiàn)光吸收光譜存在差異，這與洱海不同湖區(qū)環(huán)境條件有關(guān). 位于洱海南部的142#采樣點(diǎn)，水深較淺，2003年后沉水植物大面積退化，植物殘?bào)w沉積造成有機(jī)質(zhì)積累，加上人類活動(dòng)較為頻繁，導(dǎo)致該區(qū)域類腐殖物質(zhì)和類蛋白物質(zhì)較多，腐殖化程度和DON相對(duì)分子量較高. 46#采樣點(diǎn)位于洱海北部，彌苴河和羅時(shí)江的注入，帶來(lái)大量的陸源溶解性有機(jī)質(zhì)，造成該區(qū)域類腐殖物質(zhì)和類蛋白較豐富，微生物較為活躍，DON相對(duì)分子量和芳香性較高. 處于中部的105#采樣點(diǎn)由于水體較深，并無(wú)植物分布，加之湖泊環(huán)流等作用，陸源輸入對(duì)其影響較少，不利于類蛋白物質(zhì)積累.

表4 培養(yǎng)過(guò)程中DON變化量與各參數(shù)相關(guān)性分析

注： —為無(wú)測(cè)定；*為顯著差異；** 為極顯著差異.

任保衛(wèi)等[25]研究表明，熒光強(qiáng)度與藻生長(zhǎng)具有一定相關(guān)性，Saadi等[26]發(fā)現(xiàn)熒光峰強(qiáng)度在微生物培養(yǎng)過(guò)程初期會(huì)有不同程度的增強(qiáng)，該研究也得到了相同結(jié)論. 究其原因，微生物將大分子DON分解為小分子后，分子結(jié)構(gòu)重排使得具有剛性和共平面性的結(jié)構(gòu)增加，有機(jī)分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子的相互作用減少，減少了外轉(zhuǎn)移能量，強(qiáng)化了熒光的發(fā)射強(qiáng)度，某些具有熒光淬滅或無(wú)熒光活性的分子可能被選擇性地分解；另一原因是生物生長(zhǎng)過(guò)程中，胞外所分泌的酶溶解在溶液中，增強(qiáng)熒光信號(hào)[26-28]. 在培養(yǎng)中后期，細(xì)菌培養(yǎng)液類蛋白熒光峰消失或者強(qiáng)度有所降低，與細(xì)菌的吸收降解有關(guān). 在藻培養(yǎng)試驗(yàn)中，培養(yǎng)前期也出現(xiàn)了大分子DON分解為小分子的現(xiàn)象，但受藻類自身吸收和光降解作用的影響，三個(gè)采樣點(diǎn)的培養(yǎng)液S1、S2、S3各熒光組分的峰強(qiáng)在試驗(yàn)進(jìn)行4～7 d即出現(xiàn)下降趨勢(shì)，比菌類更快速的完成將大分子DON降解為小分子DON的過(guò)程,并且外源組分S1和S3的強(qiáng)度下降速率更大，這是因?yàn)橥庠唇M分中可生物利用部分占比更大，可更明顯的被藻類所吸收利用[25,29]. 通過(guò)紫外-可見(jiàn)光吸收光譜看出，SR指數(shù)的變化情況也進(jìn)一步證明上述結(jié)論，培養(yǎng)前期各采樣點(diǎn)SR指數(shù)均呈迅速增加趨勢(shì)，這是由于培養(yǎng)液中的DON分子量減小，且DON被菌類和藻類吸收利用，其中生物有效性更高的陸源組分S1、S3消耗量更大，內(nèi)源組分在DON中所占比重不斷上升，導(dǎo)致SR指數(shù)增加. 之后SR指數(shù)增加趨勢(shì)逐漸減緩，表明分子量不再減小，而菌藻的吸收作用還在保持. 在培養(yǎng)液起始SR指數(shù)相近的情況下，菌藻培養(yǎng)液的狀態(tài)趨于穩(wěn)定之后，藻類培養(yǎng)液的SR指數(shù)更高，這說(shuō)明藻類培養(yǎng)對(duì)外源組分的吸收效果更強(qiáng)，培養(yǎng)之后的藻類培養(yǎng)液中外源組分含量更低. 除105#采樣點(diǎn)培養(yǎng)液外，其他培養(yǎng)液的SUVA254指數(shù)均隨培養(yǎng)的進(jìn)行而降低，且與Δ(DON)呈顯著正相關(guān)(見(jiàn)表4)，這印證了熒光光譜的結(jié)果. 而藻培養(yǎng)試驗(yàn)105#采樣點(diǎn)培養(yǎng)液SUVA254指數(shù)變化不大，這是因?yàn)橹胁亢^(qū)水體相對(duì)較深，水流緩慢，適合微生物生長(zhǎng)，同時(shí)，該區(qū)域受污染程度較低，大部分易降解的大分子DON和高芳香性DON在湖體中已被微生物分解和利用，難被藻類降解的部分在沉積物中累積，所以藻類培養(yǎng)條件下藻類對(duì)該區(qū)域沉積物DON的分子量和芳香性作用不明顯.

3.3 菌藻對(duì)比培養(yǎng)條件下洱海沉積物DON生物有效性及環(huán)境指示意義

富營(yíng)養(yǎng)化是由于藻類異常繁殖而引起的[30]，利用藻類培養(yǎng)的方法能直觀地反映沉積物DON對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響. 通過(guò)筆者研究發(fā)現(xiàn)，與細(xì)菌培養(yǎng)方法相比，藻類培養(yǎng)方法在培養(yǎng)前對(duì)接種液的處理較為簡(jiǎn)單；降解的趨勢(shì)較明顯，培養(yǎng)達(dá)到最佳降解時(shí)間用時(shí)較短，對(duì)于洱海沉積物DON降解效果相當(dāng)；DON在培養(yǎng)過(guò)程中的變化與DON光譜學(xué)特征參數(shù)(熒光組分峰強(qiáng)度、SUVA254和SR)和藻細(xì)胞密度相關(guān)性較強(qiáng)，可以通過(guò)EEM-PARAFAC和紫外-可見(jiàn)光吸收光譜表達(dá)藻類培養(yǎng)過(guò)程中DON的結(jié)構(gòu)變化特征以及來(lái)源特征，利用藻細(xì)胞密度反映藻類對(duì)DON的吸收降解情況. 因此藻類培養(yǎng)方法更適合作為評(píng)價(jià)洱海沉積物DON的生物有效性的方法.

DON是湖泊沉積物影響上覆水氮濃度的重要因素[6,31]，并且極易發(fā)生衰減變化[29]，不同環(huán)境條件下沉積物DON釋放量和釋放強(qiáng)度存在明顯差異[33-34]. 不同研究區(qū)域樣品和不同的生物培養(yǎng)手段反映的DON生物有效性也存在較大差異. 烏梁素海地處蒙新高原湖區(qū)，受農(nóng)田退水、工業(yè)廢水和生活污水等外源污染嚴(yán)重，為我國(guó)中型湖泊富營(yíng)養(yǎng)化水平較為嚴(yán)重的湖泊之一[35]. 馮偉瑩等[21]通過(guò)藻類培養(yǎng)方法研究發(fā)現(xiàn)，烏梁素海沉積物樣品的DON生物有效性為62.83% ～69.83%，遠(yuǎn)高于筆者研究得到的洱海沉積物(8.46%～45.31%). Petrone等[36]對(duì)河口流域細(xì)菌培養(yǎng)條件下的DON生物有效性研究結(jié)果為4%～44%，與筆者研究細(xì)菌培養(yǎng)和藻類培養(yǎng)條件下的結(jié)果接近. 牧場(chǎng)和混合闊葉林徑流的DON中則含有較多腐殖質(zhì)類物質(zhì)，結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，腐殖化程度較高，較難被生物利用，在微生物培養(yǎng)條件下，生物有效性分別為25%和20%[23]，低于該研究的結(jié)果. 以上結(jié)果表明，洱海沉積物尚處于較為穩(wěn)定的狀態(tài)，其DON生物有效性低于正處于富營(yíng)養(yǎng)化的高原湖泊，但洱海生態(tài)系統(tǒng)演變中，分別在1996年、2003年、2013年暴發(fā)了3次較為嚴(yán)重的水華，因此仍需要重視其沉積物DON對(duì)洱海富營(yíng)養(yǎng)化的影響，特別是加強(qiáng)對(duì)受污染較為嚴(yán)重的南部和北部區(qū)域沉積物DON生物有效性的關(guān)注.

沉積物中的有機(jī)質(zhì)，在腐殖化程度較高情況下，能較好地維持其釋放轉(zhuǎn)化平衡，避免向水體中釋放過(guò)多營(yíng)養(yǎng)鹽而產(chǎn)生富營(yíng)養(yǎng)化的風(fēng)險(xiǎn). 研究[37]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)土著細(xì)菌作用，DON可被分解而產(chǎn)生藻類易利用的NH4+-N或尿素，可能促進(jìn)藻類的生長(zhǎng). 當(dāng)細(xì)菌的活性增強(qiáng)，礦化作用提高，洱海沉積物有機(jī)氮的釋放轉(zhuǎn)化平衡改變的可能性增強(qiáng)，沉積物營(yíng)養(yǎng)鹽含量較高而水質(zhì)較好的狀況會(huì)改變，引起沉積物釋放至水體中的DON增大，進(jìn)而促進(jìn)浮游植物的吸收. 該研究發(fā)現(xiàn)，藻類對(duì)洱海沉積物DON的利用率與細(xì)菌相當(dāng)，說(shuō)明在缺少細(xì)菌的作用下，洱海沉積物營(yíng)養(yǎng)鹽特別是其中的DON對(duì)藻類生長(zhǎng)有較大促進(jìn)作用，潛在的富營(yíng)養(yǎng)化風(fēng)險(xiǎn)較高.

藻菌之間可能存在競(jìng)爭(zhēng)以及互生等復(fù)雜的相互作用[38]，該研究的細(xì)菌和藻類均在獨(dú)立體系中進(jìn)行培養(yǎng)，為進(jìn)一步評(píng)估洱海污染程度和富營(yíng)養(yǎng)化風(fēng)險(xiǎn)，在后續(xù)的研究中，有必要在細(xì)菌與藻類混合培養(yǎng)條件下對(duì)洱海沉積物DON的生物有效性進(jìn)行研究.

4 結(jié)論

a) EEM-PARAFAC和紫外-可見(jiàn)光吸收光譜兩種分析手段可高效、快速地表達(dá)藻培養(yǎng)過(guò)程中DON組分結(jié)構(gòu)及來(lái)源特征. 對(duì)于洱海，由于外源組分S1、S2生物有效性較高，內(nèi)源組分S3較低，DON生物有效性表現(xiàn)為含外源組分S1、S2較多的南部，北部較高，含內(nèi)源組分S3較多的中部最低. DON生物有效性較高的南、北部湖區(qū)的潛在富營(yíng)養(yǎng)化風(fēng)險(xiǎn)較高，需要高度重視.

b) 藻類培養(yǎng)條件下洱海表層沉積物DON生物有效性(8.46%～42.46%)略低于細(xì)菌培養(yǎng)條件(10.51%～45.31%)，藻培養(yǎng)過(guò)程中，DON光譜學(xué)特征參數(shù)(SUVA254、SR)與ρ(DON)均有顯著相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性較細(xì)菌培養(yǎng)條件好. 菌藻培養(yǎng)過(guò)程中均有將各DON組分由大分子轉(zhuǎn)化為小分子后進(jìn)行吸收的現(xiàn)象，藻類的DON降解過(guò)程更迅速，對(duì)陸源DON的吸收效果更好.

c) DON生物利用率與藻細(xì)胞密度呈顯著正相關(guān)，藻生長(zhǎng)情況可以作為一種反映DON生物有效性的輔助手段. 綜合比較發(fā)現(xiàn)，藻類培養(yǎng)方法比細(xì)菌培養(yǎng)方法更適用于評(píng)價(jià)洱海沉積物DON的生物有效性.

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Bioavailability of Dissolved Organic Nitrogen in Sediment from Erhai Lake: A Comparative Study on Bacterial and Algae Incubation

XU Kechen1,2,3, ZHANG Li2,3, WANG Shengrui2,3*, WANG Shuguang1, QIAN Weibin2,3, LI Wenzhang2,3, SHI Linglong2,3

1.Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China 2.State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China 3.State Environmental Protection Key Laboratory for Lake Pollution Control, Research Center of Lake Eco-Environment, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China

This study aimed to explore the importance of dissolved organic nitrogen (DON) in the aquatic ecosystem and its ecological effects, and to find a scientific method to evaluate the bioavailability of DON and to provide a basis for further revealing the mechanism of lake eutrophication. Three-dimensional fluorescence excitation-emission matrix (3DEEM-PARAFAC) was used to estimate sediment DON bioavailability. Various components were identified by PARAFAC model according to the fluorescence excitation emission spectra. Surface sediment samples from different regions of Erhai Lake were selected to study the difference of DON content variation by comparing the cultures inoculated with bacteria and algae under room conditions. The variation characteristics for DON structures during incubation were characterized by UV-visible absorption and 3DEEM spectra. The results showed that: (1) Bioavailability of sediment DON incubated by algae (8.49%-42.5%) was slightly lower than that by bacteria (10.5%-45.3%). (2) Under algae incubation, the DON bioavailability had significant positive correlation with the growth of algae cell density, indicating algae growth could reflect sediment DON bioavailability. (3) The correlation between DON content and its spectroscopy characteristic parameters of 3DEEM, SUVA254andSRduring the incubation by bacteria was better than that by algae. SUVA254had different declining degree, andSRshowed different increasing degree, indicating DON with high molecular weight and aromaticity could be degraded by microorganisms. Compared with terrestrial PARAFAC components, autochthonous components showed higher bioavailability. (4) Compared with bacteria incubation, algae incubation method could reflect the influence of sediment DON on algae growth more directly. It could be used as a method to measure the DON bioavailability of lake sediments to some extent. In conclusion, it is more suitable to evaluate the Erhai sediment DON bioavailability by algae incubation.

dissolved organic nitrogen; sediment; bioavailability; bacteria incubation; algae incubation; EEM-PARAFAC

2016-11-14

2017-01-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U1202235，41503113)；環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索項(xiàng)目(2014-GOT-042-N-06)

許可宸(1993-)，男，安徽蕪湖人，crossxkc@163.com.

*責(zé)任作者，王圣瑞(1972-)，男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，研究員，博士，博導(dǎo)，主要從事水環(huán)境科學(xué)研究，wangshengruia@126.com

X826

1001- 6929(2017)06- 0874- 10

A

11.13198/j.issn.1001- 6929.2017.01.83

許可宸,張莉,王圣瑞,等.基于菌藻對(duì)比培養(yǎng)方法的洱海沉積物溶解性有機(jī)氮生物有效性評(píng)價(jià)[J].環(huán)境科學(xué)研究,2017,30(6):874- 883.

XU Kechen,ZHANG Li,WANG Shengrui,etal.Bioavailability of dissolved organic nitrogen in sediment from Erhai Lake: a comparative study on bacterial and algae incubation[J].Research of Environmental Sciences,2017,30(6):874- 883.