維吾爾族、漢族宮頸病變組織中HPVl6E6、E7蛋白表達研究

韓莉莉　劉曉婉　昆多孜

摘要 目的：探討維、漢族宮頸組織中HPVl6E6、E7蛋白表達差異以及引起宮頸病變中的作用機制。方法：收集宮頸組織123例，檢測HPV-DNA、E6、E7蛋白。結果：維吾爾族、漢族E6、E7蛋白在不同等級宮頸病變中表達率差異具有統計學意義（P<0.005）。維吾爾族不同等級宮頸病變組織HPV陽性率比較差異具有統計學意義（P<0.005）。結論：維、漢族宮頸病變組織中HPVl6E6、E7蛋白陽性表達率差異有統計學意義，維吾爾族中隨著宮頸病變級別增加，HPV陽性率增加，E6、E7蛋白檢測可預測宮頸病變進展及預后。

關鍵詞 宮頸病變；E6、E7蛋白；HPV

1992年WHO宣布人類乳頭狀瘤病毒（HPV）是引起宮頸癌變的首要因素。HPV兩個早期編碼框架E6/E7基因的表達產物E6/E7原癌蛋白在腫瘤發生、細胞周期調控及凋亡調節中起重要作用，是宮頸癌發生、發展的重要原因。但有關癌組織中E6/E7蛋白表達在宮頸癌發生、發展中的作用及其相互關系仍有爭論。本研究通過研究HPVl6E6、E7蛋白與宮頸上皮內瘤變的發生與發展以及與宮頸癌相關性，為宮頸癌早期診斷與早期防治提供新的手段。

資料與方法

2010年9月-2013年3月新疆維吾爾自治區人民醫院婦科門診及住院患者手術或活檢存檔蠟塊，其中鱗癌51例，年齡26～65歲；宮頸上皮內瘤變CIN I級22例，年齡24～56歲；CINⅡ～Ⅲ期40例，年齡35～65歲，宮頸炎30例，年齡21～56歲。采取全部患者標本后甲醛固定，石蠟包埋，切片，常規HE染色，確定病理學診斷、組織學類型；患者均為無宮頸手術史、未行過宮頸物理治療及干擾素治療、受試時未懷孕、無化療史及骨盆放射治療史的婦女。入選病例均經病理診斷明確。

方法：切除部分標本經過甲醛充分固定、取材并常規脫水、透明后，以石蠟包埋備用。全部標本均經10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，連續切片，4um厚，以備常規病理和免疫組化用；一抗HPV16E6、E7鼠抗人多克隆抗體購自北京博奧森，二抗試劑盒（兔抗鼠）、二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑均購自北京中山生物公司；實驗方法采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法，HPVl6E6、E7-抗濃度1：100，二抗為即用型工作液，DAB顯色，伊紅染液復染。染色步驟嚴格按試劑盒說明書進行，分別用已知宮頸癌陽性切片做陽性對照，以磷酸緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。

判斷標準：HPV16E6/E7蛋白以胞質、細胞核和核周緣出現棕黃色顆粒為陽性。在高倍鏡下（400×）對每張切片隨機選擇了5個視野，共計1 000個腫瘤細胞，其中陽性細胞數<5%為陰性（-），陽性細胞數5%～10%為弱陽性（+），陽性細胞數11%～50%為中度陽性（++），陽性細胞數>50%為強陽性（+++）。統計陽性表達的例數，并進行比較分析。

統計學方法：數據分析采用SAS 9.0進行統計學分析，計數資料采用x2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結果

維吾爾族、漢族不同宮頸病變級別中E6、E7蛋白陽性率比較：漢族E6蛋白在宮頸炎、CIN Ⅰ、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸癌組陽性表達率分別為0.00%（0/0）、23.08%（3/48）、55.56%（10/48）、100%（6/48）；維吾爾族E6蛋白在宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸癌組的陽性表達率分別為5.26%（1/75）、44.44%（4/75）、72.73%（16/75）、100%（24/75）；漢族E7蛋白在宮頸炎、CIN Ⅰ、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸癌組陽性表達率分別為0.00%（0/0）、23.08%（3/48）、72.22%（13/48）、100%（6/48）；維吾爾族E7蛋白在宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸癌組陽性表達率分別為10.53%（2/75）、33.33%（3/75）、68.18%（15/75）、100%（92/75）。維吾爾族、漢族E6、E7蛋白在不同等級宮頸病變中表達率差異具有統計學意義（P<0.005）。見表1～4。

維吾爾族、漢族宮頸不同病變級別HPV陽性率比較：漢族患者中在宮頸炎、CIN Ⅰ、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸癌組HPV陽性率分別為91.30%（10/11）、100.00%（13/13）、87.50%（14/16）、83.33%（5/6）；維吾爾族患者在宮頸炎、CIN Ⅰ、CINⅡ一Ⅲ級、宮頸癌組HPV陽性率分別為31.58%6/19）、88.89%（8/95）、81.82%（18/22）、100%（25/25）。其中維吾爾族不同等級宮頸病變組織HPV陽性率比較差異具有統計學意義（P<0.005），見表5、6。

討論

宮頸癌危害著女性身體健康，女性發病率高的生殖道惡性腫瘤中宮頸癌排在第1位。目前國內外研究者從RNA、DNA和蛋白水平等其他方面不斷研究子宮頸癌的發病機制和早期防治。HPV感染機體的宿主細胞后，在宿主細胞中HPV基因組是兩種存在狀態：游離狀態和整合狀態。在良性宮頸病變中HPVDNA大多以游離狀態存在，但在惡性病變中多數是以整合狀態存在。而且低危型HPV DNA游離狀態多，幾乎不整合到宿主細胞的基因組中去，但絕大多數高危型HPV DNA能整合到宿主細胞DNA中，會引起基因突變、缺失，許多抑癌基因和癌基因的表達被干擾，進一步加快了CIN進展為宮頸浸潤癌的可能性。一般HPV感染的早期，HPV病毒癌基因表達水平低，在病毒基因組不斷整合到宿主基因組的過程中，HPVE6/E7mRNA會出現持續的高水平轉錄，E6、E7癌蛋白被大量表達，促使宮頸病變繼續發展為宮頸癌。

HPVE6癌蛋白各個型別的蛋白中都存在一個鋅指結構Cys-x-x-Cys。P53和E6關聯蛋白（E6-AP）的結合可以影響細胞周期。P53是細胞周期調控、凋亡控制和基因轉錄過程中一個關鍵的蛋白。HPV陽性的細胞主要靠E6關聯蛋白介導降解，在出現刺激或者DNA損傷時，P53會被正常細胞激活，由于下游基因的轉錄被抑制，細胞停滯在s期，DNA經過修復進入細胞周期；完成有絲分裂；但高危型HPVE6的細胞可以通過降解P53，使細胞略過檢驗點G1/S，這些細胞積累了損傷的DNA，繼續進入細胞周期，引起基因組的不穩定性。

E6和E7蛋白都有單獨引起人類細胞的永生化的能力，但E6、E7同時表達時有協同作用一，它們協同后使細胞周期脫耦聯以及中心體復制，紡錘體檢測點功能被干擾，引起基因組完整性變化以及中心體數目變化，最終引起腫瘤的出現。研究顯示E6蛋白的轉化能力低于E7蛋白，疾病早期E7蛋白表達較多，疾病晚期E6蛋白表達較多，在惡性病變中E6蛋白中表達較多。

本研究發現在漢族、維吾爾族不同級別宮頸病變組織中E6、E7蛋白的陽性率差異具有統計學意義。隨著宮頸病變級別的增加，HPVl6E6、E7蛋白表達也增加。在維吾爾族患者中隨著宮頸病變級別的增加，HPV陽性率也增加，差異有統計學意義。但在漢族不同宮頸病變級別中HPV陽性率差異無統計學意義，可能和樣本偏少有關。建議臨床在開展HPVDNA檢測的同時，必要時做HPVl6E6、E7蛋白檢測，特別對于HPV持續感染者有較顯著的意義，為宮頸癌的早期診斷和預防提供一種新的預警手段。