GFP-Nurr1基因修飾神經干細胞的建立及過表達Nurr1對神經干細胞向多巴胺神經元分化的影響

陳孝祥， 宋曉斌， 王向鵬， 徐蛟天， 林 海， 王 威， 楊智勇， 鄧興力

GFP-Nurr1基因修飾神經干細胞的建立及過表達Nurr1對神經干細胞向多巴胺神經元分化的影響

陳孝祥， 宋曉斌， 王向鵬， 徐蛟天， 林 海， 王 威， 楊智勇， 鄧興力

目的 利用慢病毒載體建立GFP-Nurr1基因修飾的原代神經干細胞(NSCs)模型并觀察Nurr1過表達后NSCs向多巴胺神經元的分化影響。方法 利用基因重組構建pLenO-DCE-Nurr1慢病毒載體，用慢病毒轉染第三代NSCs，轉染72 h后熒光檢測轉染效果；設置空白對照組、空載體組及DCE-Nurr1組，分別用Western blot及PCR檢測Nurr1的表達差異；并將轉染后的NSCs分化培養7 d后分別用免疫細胞化學檢測、Western blot及PCR檢測酪氨酸羥化酶(TH)的表達。結果 慢病毒轉染NSCs 72 h后，轉染率可達90%，與對照組相比DCE-Nurr1組高表達Nurr1。經慢病毒載體感染后的NSCs仍具備分化潛能，分化培養后發現DCE-Nurr1組分化的神經細胞中TH陽性細胞分化率90.60%，對照組為21.2%。結論 慢病毒載體可高效轉染NSCs過表達Nurr1；Nurr1基因過表達可以促進中腦腹側來源NSCs向TH陽性多巴胺能神經元方向分化。

Nurr1； 基因修飾； 慢病毒； 神經干細胞

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的典型運動癥狀主要表現為運動徐緩，靜止性震顫及肌強直，主要由于中腦黑質多巴胺神經元(dopaminergic neuron，DA neuron)的漸進性變性丟失引起，目前尚無治療方法可延緩其疾病進程[1]。根據近幾年的研究表明，神經干細胞(neural stem cells，NSCs)具有多分化潛能，能體外培養誘導成神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞，因此通過移植神經干細胞有望成為PD治療的新希望。目前，已在PD動物模型上得到證實，通過移植體外培養的NSCs后能改善PD動物行為學癥狀[2，3]。但單純神經干細胞移植治療PD也面臨諸多問題，其中如何使移植后的NSCs最大程度的分化成有功能的DA神經元是亟待解決的問題。核受體相關基因1(nuclear receptor related 1 gene，Nurr1)屬于孤束核受體家族成員之一，前期大量研究表明Nurr1 對多巴胺能神經元的發育、生存和功能維持起著重要的作用，并且通過敲除小鼠Nurr1基因發現Nurr1-/-小鼠不能產生中腦多巴胺能神經元[4]。因此通過Nurr1基因修飾神經干細胞有望使移植后的NSCs最大程度分化成TH陽性的DA神經元。雖然國內曾有研究報道利用電穿孔法轉染神經干細胞使其過表達Nurr1，但轉染后NSCs分化成DA神經元的比例并不高。因此，本研究通過體外細胞實驗，利用慢病毒載體將中腦腹側來源原代培養的NSCs過表達Nurr1，觀察其分化情況，旨在提高NSCs過表達Nurr1后向DA神經元的轉化率，為進一步體內動物實驗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物與細胞 SD(Sprague-Dawley)雄、雌性大鼠均購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SYXK(滇)2011-0004)。將SD雌性大鼠與雄性大鼠合籠受孕，原代神經干細胞取自孕12.5～14.5 d胎鼠中腦腹側組織培養而來。

1.1.2 主要實驗試劑 DMEM/F12、DMEM/high glucose購自HyClone；L-谷氨酰胺(L-Glutamine-200 mM)、青霉素-鏈霉素雙抗及B27(B-27 Supplement Minus Vitamin A 50X)均購自Invitrogen公司；山羊血清購自索萊寶公司；堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)均購自Peprotech 公司；D-葡萄糖購自大連美侖、多聚-D-賴氨酸購自 Sigma公司；胎牛血清(feta l bovine serum，FBS)購自BI公司；DAPI購自碧云天公司；兔巢蛋白抗體(rabbit anti-Nestin)、兔β微管蛋白Ⅲ抗體(rabbit anti-Ⅲ β-tubulin)、兔膠質纖維酸性蛋白抗體(rabbit anti-GFAP)、兔酪氨酸羥化酶抗體(rabbit anti-TH)及Alexa Fluor594標記羊抗兔IgG(Alexa Fluor594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG)均購自proteintech公司。RIPA裂解液購自索萊寶公司，FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根公司。

1.1.3 慢病毒載體及引物設計 pLenO-DCE-Nurr1慢病毒載體攜帶GFP報告基因和Nurr1目的基因，由本課題組前期構建。RT-PCR(reverse transcription-PCR)所用Nurr1及TH引物由primer5軟件設計，引物購自Invitrogen公司。Nurr1(forward：5’-AAGCCACCTTGCTTGTACCAAA-3’，reverse：5’-CTTGTAGTAAACCGACCCGCTG-3’)；TH(forward：5’-CAGGGCTGCTGTCTTCCTAC-3’，reverse，5’-GGGCTGTCCAGTACGTCAAT-3’)；DAT(forward：5’-TTGCAGCTGGCACATCTATC-3’，reverse：5’-ATGCTGACCACGACCACATA-3’)；GAPDH(forward：5’-TGCCTCCTGCACCACCAACT-3’，reverse：5’-CCCGTTCAGCTCAGGGATGA-3’)。

2.3 NSCs過表達Nurr1后的分化培養結果 將空白對照組及DCE-Nurr1組分別分化培養7 d后，經免疫熒光實驗發現，與對照組相比，DCE-Nurr1組TH+的DA神經元明顯增多(90.60%，而對照組為21.2%)，且胞體大，突起長(P<0.001)(見圖3A-C)。同時，我們發現在DCE-Nurr1組分化后的細胞仍表達GFP，但大部分表達GFP的細胞并非TH+細胞(見圖3D)，提示過表達的Nurr1在NSCs分化后有可能更多的位于膠質細胞。因此，我們進一步通過熒光共定位進行了確認，發現來自慢病毒載體的GFP大多表達于GFAP陽性的膠質細胞上(見圖4)。另外，為進一步驗證經Nurr1處理后分化得到的DA神經元是否具有成熟DA神經元特點，我們進一步檢測了這兩組間TH和DAT(dopamine transporter，DAT)在mRNA和蛋白水平上是否有表達差異。通過Western blot及RT-PCR發現，與對照組相比DCE-Nurr1組分化得的DA神經元TH和DAT均上調(見圖5)，說明經Nurr1過表達修飾后能促進NSCs向DA神經元分化，且具備成熟DA神經元功能。

1.2.1 中腦腹側NSCs的培養及鑒定 7%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉孕12.5～14.5 d的SD大鼠，無菌條件下取出胎鼠后用DMEM/high glucos溶液漂洗兩次，解剖顯微鏡下分離胎鼠取中腦腹側組織；將組織剪碎后加入NSCs完全培養液(含20 ng/ml的EGF、20 ng/ml的bFGF、2%的B27、1%的L-谷氨酰胺)，1 ml移液器槍頭吹打后，經70 μm濾網過濾，1000 r/min離心5 min收集細胞后加入完全培養基重懸，按2×105個/ml細胞密度接種于培養瓶中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養7 d，每天顯微鏡下觀察細胞生長情況，隔天半量換液1次。原代培養7 d后機械分離神經球進行傳代培養，取第三代(P3)神經球用巢蛋白(Nestin)鑒定，并用10%FBS分化培養液(撤去EGF和bFGF)分化培養后鑒定其多向分化能力。

2.1 中腦腹側NSCs的生長特點及鑒定 原代NSCs從中腦腹側分離后接種于25 cm2培養瓶培養，培養1～2 d，大部分細胞均貼壁并漸死亡，2～3 d后，倒置顯微鏡下可觀察到少許神經干細胞開始聚集成簇，培養5～7 d后可形成直徑150 μm～200 μm大小的神經球，經神經干細胞標志物巢蛋白(Nestin)鑒定呈陽性。將培養至7 d的神經球進一步分化培養，在分化培養液(含10%胎牛血清)作用下，神經球漸分化，球體周圍生出長突起，分化培養7 d后大部分神經球均分化，經免疫熒光鑒定分別呈微管蛋白(Tuj1)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)陽性(見圖1)，說明中腦腹側來源腦組織可經體外培養成神經干細胞，且有多向分化能力。原代培養神經球5～7 d后，可見球體中間細胞漸發暗，為營養供應不足引起，應及時傳代處理。

1.2.4 Western Blot及PCR驗證 仍分別設置空白對照組及DCE-Nurr1組，將P3代神經球接種于6孔板中。DCE-Nurr1組神經球轉染Nurr1培養72 h后用分化培養液培養；空白對照組不予慢病毒處理，直接用分化培養液培養(與DCE-Nurr1組同一時間開始分化培養)。兩組分化培養7 d后分別提取蛋白及總RNA，用western blot及PCR檢測兩組間TH表達情況。

1.2.3 NSCs過表達Nurr1后的分化培養及免疫熒光鑒定 設置空白對照組及DCE-Nurr1組，將P3代神經球接種于鋪有細胞爬片(爬片經多聚賴氨酸處理)的24孔板中。DCE-Nurr1組神經球轉染Nurr1培養72 h后用分化培養液培養；空白對照組不予慢病毒處理，直接用分化培養液培養(與DCE-Nurr1組同一時間開始分化培養)。將兩組分別分化培養7 d后取出爬片，用PBS洗滌5 min×3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.3%的Triton處理15 min，PBS洗滌5 min×3次，10%山羊血清封閉1 h后，滴加一抗兔抗TH多克隆抗體(1∶200)后4 ℃過夜；次日早上再PBS洗滌3次，滴加二抗(山羊抗兔Alexa Fluor594，1∶500)后室溫孵育2 h；PBS洗滌3次后DAPI染核(DAPI為碧云天產品，使用濃度為5 μg/ml)；熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。

1.2.2 NSCs過表達Nurr1模型的建立及鑒定 pLenO-DCE-Nurr1慢病毒由本課題組前期構建保存，攜帶GFP報告基因和Nurr1目的基因。在轉染前，首先收集P3代NSCs至離心管并1000 r/min×5 min離心，用完全培養基重懸，機械吹打盡量分散神經球，按2×105個/ml接種于六孔板，感染復數(MOI)按預實驗取200，計算出病毒數后加入NSCs培養板，37 ℃、5% CO2培養箱中培養72 h后熒光顯微鏡下觀察轉染情況。分別設置空白對照組、空載體組及DCE-Nurr1組?？瞻讓φ战M不用慢病毒感染，空載體組用攜帶GFP(綠色熒光蛋白)但不含目的基因Nurr1的慢病毒轉染，DCE-Nurr1組用含GFP-Nurr1的慢病毒處理，將3組分化培養72 h后分別提蛋白及總RNA，進一步用Western blot及PCR檢測3組Nurr1表達情況。

其二，從研究熱點主題來看，近十年來研究熱點主題一直在不斷演變與擴展。根據關鍵詞共現與聚類分析可知，武術文化研究主要圍繞著非物質文化遺產視域下的武術文化保護與發展；中國傳統武術自身的現狀、困境與發展路徑；中國武術文化的國際化傳播與推廣；武術文化的文化精神；學校武術教育中的文化反思；地域武術文化與民間武術文化的發展等幾個方面的探索。

職業導游能力，是指職業導游所具備的基本的和必要的職業能力和素養，換言之，職業導游能夠成功地輕松地從事導游服務工作所具備的所有能力的特征和職業素養的總和。社會實踐中，職業導游，應該能夠做好向導和講解工作，能夠做好游客的安全，做好旅游資源的推薦，做好游客出游活動的建議，有良好的品質和技能，語言表達、行為判斷、組織協調能力，同時也要有專業的廣博的知識內涵。

2 結 果

Third is viability,since Zhuang drama emerge in the folk,most of its contents were transmitted from generation to generation through folk artists’oral teaching and demonstration.

2.2 pLenO-DCE-Nurr1慢病毒對NSCs的轉染 在本實驗中，我們發現在P3代培養至5～7 d的神經球中加入DCE-Nurr1慢病毒感染24 h后即可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，轉染72 h后大部分神經球均表達綠光，有些神經球可漸貼壁分化(見圖2A、2B)，轉染后培養7 d大部分神經球均分化。分別用Western bolt及PCR比較空白對照組、空載體組及DCE-Nurr1組，發現空白對照組與空載體組比較Nurr1表達無統計學意義(P>0.05)，而DCE-Nurr1組較其余兩組相比均高表達Nurr1，統計分析存在顯著性差異(P<0.001)(見圖2C、2D)。結果說明以慢病毒為載體可使NSCs高效過表達Nurr1。

1.2 方 法

加里克 · 阿瓦內齊安,捷克人。1959年生于巴庫,出版商。1988年至1992年居住在哈薩克斯坦,1992年至1994年在莫斯科工作,1995年以來居住在布拉格,2012年獲MFIAP榮譽,在世界30多個國家參加國際攝影沙龍和展覽會300余次。

圖1 NSCs鑒定及分化培養后鑒定。原代神經球培養7 d(A)，經過巢蛋白(Nestin)鑒定陽性(B)；將P3神經干細胞分化培養后并鑒定，分別呈GFAP及Tuj1陽性(C-D)。標尺(A-D)=20 μm

圖2 pLenO-DCE-Nurr1慢病毒轉染NSCs。P3代神經干細胞經pLenO-DCE-Nurr1慢病毒轉染后72 h可見明顯綠色熒光(A-B)，并經western blot及PCR進一步得到驗證(C-D)：經pLenO-DCE-Nurr1慢病毒系統可成功構建NSC過表達Nurr1模型。標尺(A-B)=100 μm

圖3 過表達Nurr1促進NSCs向DA神經元分化。與對照組相比，DCE-Nurr1組TH+細胞明顯增多(見圖A～C，***P<0.001)；DCE-Nurr1組分化后的細胞仍表達GFP，但大部分未共定位于TH+細胞。標尺(A，B及D)=20 μm

圖4 熒光共定位檢測GFP分布。通過熒光共定位發現，慢病毒攜帶的GFP在NSCs分化后，大部分共定位與GFAP+細胞。標尺(A-D)=20 μm

圖5 與對照組相比DCE-Nurr1組分化得的DA神經元TH和DAT均上調。(**P<0.01，****P<0.0001)

3 討 論

近年來因為老齡化諸多等原因，一些神經退行性疾病的發病逐年增加，特別是帕金森病(PD)，有Meta研究分析指出截止到2014年，年齡大于40歲的女性PD患病率達到了37.55/10萬，而年齡大于40歲的男性則達到了61.21/10萬[5]。雖然PD的患病率正逐年增加，但現有的PD治療均仍只能暫時緩解其臨床癥狀，并不能延緩疾病進展，大部分患者最終仍因疾病導致生活能力喪失，甚至精神障礙。自1992年Reynolds和Weiss首次成功體外培養神經干細胞后[6]，對于神經干細胞(NSCs)的研究一直不斷，并漸將其用于PD治療的研究。但在細胞移植治療PD過程中如何把握NSCs的分化命運，將其引導分化成具有成熟功能的DA神經元的報道則較少。

核受體相關基因1，也稱核受體第4A亞家族第2成員(nuclear receptor subfamily 4，group A，member 2，NR4A2)，屬于孤束核受體。早期的研究發現，鼠來源Nurr1在胚胎10.5 d即在中腦腹側表達，并且持續表達于成年腦組織的中腦腹側和黑質區[7]。此后，多項研究通過基因敲除證實，Nurr1基因的表達與DA神經元的發育合成、成熟及維持均密切相關[8]。這些研究表明，在多巴胺神經元前體細胞(如神經干細胞)向DA神經元方向分化的過程中，Nurr1基因的調控占重要作用[9]。在本實驗中，為了研究過表達Nurr1基因對NSCs向多巴胺神經元的分化影響，本課題組構建了攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的pLenO-DCE-Nurr1慢病毒載體，通過轉染72 h后細胞的GFP熒光表達來初步確定轉染效果，然后將NSCs進一步分化培養后通過Western blot、RT-PCR及免疫熒光來分析TH+多巴胺神經元的分化率。實驗結果發現，與對照組相比，過表達Nurr1基因的NSCs分化培養后TH+細胞率明顯升高，可達90.60%。進一步研究發現，相對于對照組，這些經Nurr1轉染后分化獲得的細胞高表達多巴胺轉運體(Dopamine Transporter，DAT)及酪氨酸羥化酶(TH)等標志DA神經元成熟的基因。說明過表達Nurr1能促進NSCs向成熟DA神經元分化。另外，在本研究中，還發現慢病毒載體可使NSCs穩定持續過表達Nurr1，甚至在分化培養7 d后的細胞上仍能檢測到較強的GFP熒光，進一步通過熒光共定位發現，這些通過慢病毒轉染的GFP大多表達于GFAP陽性的膠質細胞上。Saijo等研究提出[10]Nurr1可以通過作用于小膠質細胞和星形膠質細胞來減少炎癥因子的分泌從而起保護多巴胺神經元的作用。結合Saijo等研究，可以認為經Nurr1修飾后的NSCs用于移植治療PD動物模型，不但能夠促進NSCs定向分化為成熟的DA神經元，而且Nurr1還極有可能作用于分化后的星形膠質細胞來和局部移植區的小膠質細胞來減少炎癥因子的分泌，從而保護經移植分化而來的DA神經元和宿主腦內殘留的DA神經元的存活。但具體Nurr1通過什么機制及信號通路來發揮以上作用，還需體內動物實驗進一步研究。

目前對于NSCs的基因轉染，有病毒轉染法和非病毒轉染法，其中病毒轉染法主要有慢病毒轉染法和腺病毒及腺相關病毒轉染法。Stephanie M等研究表明腺病毒及腺相關病毒對于神經前體細胞的轉染效率不高[11]。故在本研究中，我們構建了pLenO-DCE-Nurr1慢病毒載體，除了目的基因Nurr1外，還攜帶綠色熒光蛋白(GFP)，可在轉染后直接通過熒光顯微鏡觀察GFP的熒光表達情況來判斷轉染效果。在前期預實驗中我們發現當MOI小于150，轉染72 h后大部分神經球均只有球體周圍表達綠色熒光，而將MOI提高至200時，大部分神經球均能在轉染72 h后穩定表達綠色熒光，并能成功分化培養。經過Western blot及RT-PCR分析驗證，通過慢病毒載體轉染(MOI=200)，可使NSCs轉染效率大于90%，高于國內譚雪峰等利用電穿孔法轉染神經干細胞的轉染效率(35%)[12]。雖然本實驗研究結果表明，經慢病毒載體可高效轉染NSCs過表達Nurr1基因，并促進NSCs向多巴胺神經元分化，但較之電穿孔等非病毒轉染法，慢病毒轉染后的NSCs移植于體內后是否會增加致瘤性仍有待進一步動物實驗考證。

對于B和C類型乘客，無法直觀確定其下車站點，可以采用概率的方法求得在各個站點下車的概率，選取概率最高者為其下車站點，B類型乘客存在歷史相似出行記錄，因此其概率是站點上車次數與線路乘坐次數的比值；C類型乘客，出行鏈較為殘缺，沒有歷史出行記錄，因此其概率算法為類型乘客在站點i上車，則在該線路下行站點j…n下車的概率為乘客乘坐該線路在各站點的上車次數. C類型乘客在站點i上車，則在該線路下行站點j…n，下車的概率該站點上車人數，為該站點所有下游站點的上車總人數.

總之，通過本實驗可以明確，慢病毒可使NSCs高效過表達Nurr1基因，且過表達Nurr1基因后能促進NSCs向成熟多巴胺神經元轉化。通過實驗還發現轉染后的慢病毒攜帶的綠色熒光大部分分布于膠質細胞，這是否說明轉染后Nurr1還可作用并調控膠質細胞則需進一步研究。另外，Chung S等[13，14]研究指出Nurr1是在Shh-FoxA2 和 Wnt1-Lmx1a兩條信號通路共同調控下參與DA神經元的發育合成的。但通過慢病毒體外轉染NSCs，促進轉染后的NSCs向DA神經元轉化是否通過作用于以上兩條通路來發揮作用尚不清楚，需進一步研究探討。

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[4]Saucedo-Cardenas O，Quintana-Hau JD，Le WD，et al. Nurr1 is essential for the induction of the dopaminergic phenotype and the survival of ventral mesencephalic late dopaminergic precursor neurons[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(7)：4013-4018.

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Establish the GFP-Nurr1 modified NSCs and the impact on the differentiation of neural stem cells by Nurr1 Overexpression

CHENXiaoxiang，SONGXiaobing，WANGXiangpeng，etal.

(DepartmentofNeurosurgery，theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650032，China)

Objective To establish the GFP-Nurr1 modified NSCs model via Lentiviral vectors and observe the impact on the differentiation of neural stem cells by Overexpression of Nurr1.Methods pLenO DCE-Nurr1 lentiviral vectors was constructed by genetic recombination technology. P3 NSCs were infected with lentiviral vectors and the effect of transfection was measured by fluorescence expression after 72 hours. The expression of Nurr1 between three groups，which includes control group，empty vector group and DCE-Nurr1 group，was analyzed by Western blot/PCR respectively. The expression of TH among three groups was analyzed via immunofluorescence，Western blot and PCR after 7-days differentiation culture of the transfected NSCs. Results Approximately 90% of NSCs can be transfected by pLenO-DCE-Nurr1 after 72 hours. Nurr1 expression was upregulated in DCE-Nurr1 group，compared to control group. NSCs remains the capacity to differential after transfected by lentiviral vectors，and the TH positive cells was 90.60%，while only 21.2% in the control group. The expression of TH and DAT was also upregulated in DCE-Nurr1 group. Conclusion NSCs overexpression of Nurr1 can be mediated by lentiviral vectors with high efficiency. NSCs derived from embryonic mesencephalic can be induced to TH positive dopaminergic neurons via overexpression of Nurr1.

Nurr1； Gene modification； Lentiviral vectors； Neural stem cells

2017-03-15；

2017-04-18

國家自然科學基金地區科學基金項目(No. 81360197)；國家自然科學基金項目(No. 81241126)；云南省教育廳科學研究基金項目(No. 2013C227)；云南省干細胞與再生醫學重點實驗室開放課題(No. 201401UH00160) 作者單位：(昆明醫科大學第一附屬醫院神經外科，云南 昆明 650032)

鄧興力，E-mail：dxlkmmu@163.com

1003-2754(2017)05-0388-05

R651

A