納米ZnO/殼聚糖復合膜的性能及在冷鮮豬肉保藏中的應用

匡衡峰，胡長鷹，溫曉敏，呂景泉

1(暨南大學 包裝工程研究所，廣東 珠海，519070) 2(暨南大學 食品科學與工程系，廣東 廣州，510632) 3(廣東普通高校產品包裝與物流重點實驗室，廣東 珠海，519070)

納米ZnO/殼聚糖復合膜的性能及在冷鮮豬肉保藏中的應用

匡衡峰1，胡長鷹2,3*，溫曉敏2，呂景泉2

1(暨南大學 包裝工程研究所，廣東 珠海，519070) 2(暨南大學 食品科學與工程系，廣東 廣州，510632) 3(廣東普通高校產品包裝與物流重點實驗室，廣東 珠海，519070)

對以50 nm ZnO和殼聚糖為原料制備的復合抗菌膜性能進行了研究。通過紅外光譜儀(FTIR)、X-晶體衍射(XRD)、掃描電鏡(SEM)、X射線分析顯微鏡(XGT)分析納米顆粒分布和膜形態，抑菌圈和抑菌率分析膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，同時研究復合膜作為包裝襯墊在鮮豬肉冷藏保鮮中的效果。結果表明納米ZnO能很好地融入殼聚糖基體中，能改善殼聚糖膜內部結晶，并能提高復合膜的抑菌圈效果，且低濃度復合膜抑菌圈效果更明顯；添加濃度為10%的復合膜比空白殼聚糖膜抑菌率提高10%，達到93%；復合膜在冷藏條件下能較好控制鮮豬鮮肉的揮發性鹽基氮和微生物總數，作為內包裝襯墊在鮮肉鮮度的控制上有明顯效果。

殼聚糖；納米ZnO；復合抗菌膜；鮮肉保鮮

殼聚糖是僅次于纖維素的第二大天然可再生聚合物，在醫療、食品、材料等領域都有廣泛應用[1-3]。殼聚糖能溶于弱的醋酸或甲酸中，在食品包裝中主要通過涂膜[4]或制成膜材來使用。通過溶液成膜法可以將殼聚糖制成具有較好物理機械性能和優良透明性的包裝膜材[5-7]。在成膜過程中添加有效成分可以改進膜的性能[8]，這也是近年研究殼聚糖膜改性的熱點。

殼聚糖膜材中添加納米材料可以增加膜內部交聯，促進膜內部結晶進而提高膜材的各項物理性能[9-10]。ZnO能與殼聚糖分子良好結合并改善膜的機械性能和抗菌性能[6]，以涂膜和成膜方式在包裝中應用較多。美國FDA將ZnO認定為一般安全物質[11]，有研究表明ZnO不會對人體細胞DNA造成損傷，但納米ZnO可以通過粒子釋放離子，激發活性氧和直接接觸破壞的方式對微生物的細胞生長產生抑制作用[12]。近年研究表明納米ZnO不同粒徑、添加量、形貌等對殼聚糖復合膜機械性能、透氧透濕性能以及抗菌效果有明顯影響[13- 14]。研究同時也表明殼聚糖復合膜容易發生溶脹，且封口性能不好，作為外包裝來使用有一定不足。本研究將不同濃度50 nm顆粒狀ZnO加入殼聚糖中，制備厚度適中的納米復合膜，并將復合膜作為內包裝襯墊應用在冷鮮肉保藏中，探究在新包裝形式下復合抗菌膜的實際應用效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖(分析純，脫乙酰度≥90.0%)，上海泰坦科技股份有限公司；納米ZnO(50 nm，純度99.8%)，aladdin試劑；PBS緩沖液，武漢博士德生物；丙三醇(分析純)，上海泰坦科技股份有限公司；乙酸(分析純)，廣州化學試劑廠；吐溫-80(分析純)，天津化學試劑廠；LB營養瓊脂、LB肉湯,天津博科科技有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌,暨南大學食品科學與工程系提供。

1.2 儀器與設備

鋪膜設備(15 cm×24 cm 有機玻璃板，誤差小于0.5 cm)，實驗室自制；SW-CJ-1B 型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；PYX-250S-B型生化培養箱，韶關市科力儀器有限公司；數位式游標卡尺,日本三豐公司；數顯測厚儀，品牌AICE/艾測；UV-9600 型紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；EQUINOX55 型傅立葉紅外光譜儀，德國布魯克光譜儀器公司；PHILIPS XL30ESEM型掃描電子顯微鏡，荷蘭飛利浦公司；XD-2 X射線衍射儀，北京微構分析；XGT-5200X HORIBA X射線分析顯微鏡，日本；STD-XG揮發性鹽基氮檢測儀，廈門斯坦道科學儀器；PH-3C精密pH計，上海儀電科學儀器。

1.3 實驗方法

1.3.1 納米ZnO/殼聚糖膜的制備方法

根據YOUSSEF等的方法[6]，稱取一定量的殼聚糖溶于100 mL的體積分數為3%乙酸溶液中，攪拌至殼聚糖完全溶解，加入體積分數為0.5%的甘油攪拌30 min，加入體積分數為0.1%吐溫-80作為乳化劑攪拌10 min。另取燒杯加入20 mL蒸餾水，按設計比例加入納米ZnO，攪拌、超聲分散，最后混合兩燒杯溶液繼續攪拌20 min。利用溶液成膜法將全部溶液倒在水平有機玻璃板上，放置于鼓風干燥箱中50 ℃烘干7 h，然后從玻璃板上揭下膜材25 ℃下備用。其中按照粒徑+ZnO/殼聚糖質量比進行編號，5010表示50 nm添加量濃度為10%(W/W，ZnO/Chitosan)的配方，5003表示50 nm添加濃度為3%(W/W，ZnO/Chitosan)的配方，空白膜記為CS；對照組采用同等面積聚乙烯膜，記為PE。

1.3.2 復合膜基本參數測定

研究中復合膜主要作為內包裝襯墊來使用，需要測定膜材的不透明度、厚度、克重、含水量參數[15]。

1.3.2.1 膜厚度測定及克重計算方法[16]

取備用膜材利用數位式游標卡尺測定膜上分散的10個點，記錄取平均值；稱量3 cm×3 cm膜材質量，計算單位面積膜質量，平行3次，單位g/m2。

1.3.2.2 復合膜不透明度測定[17]

測定600 nm可見光波長處膜的透過率值，按照以下公式計算，5次平行

(1)

式中：T600為樣品在600 nm處光透過率；X為膜材厚度，mm。

1.3.2.3 復合膜含水量測定[5-6]

室溫下取膜材剪切為3 cm×3 cm片狀，恒重記為m0；放入干燥玻璃培養皿中，105 ℃條件下烘干24 h，記錄質量m1，含水量以以下公式進行計算

(2)

1.3.3 膜微觀結構表征[8,17]

1.3.3.1 紅外光譜分析

利用紅外光譜儀衰減全反射ATR對殼聚糖復合膜進行掃描分析(測試過程中膜材對折2次)，掃描波數范圍600～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，連續掃描64次。

1.3.3.2 納米顆粒宏觀分布狀況分析

截取3 cm×3 cm膜材放置于XGT-5200 X射線分析顯微鏡掃描平臺，連續掃描2次。

1.3.3.3 X射線衍射分析

取2 cm×3 cm的膜材緊貼于載玻片進行測試，測試采用銅靶，掃速8°/min，記錄步長0.05°，掃描角度(2θ)5°～80°。

1.3.3.4 掃描電鏡分析

利用直徑打孔器6 mm取膜材一片緊貼于貼有導電膠的銅臺表面，噴金處理后在掃面電子顯微鏡下掃描，信號采用InLens信號，加速電壓5 kV，拍取20 000倍和40 000倍清晰圖像。

1.3.4 抑菌性能及實際應用

1.3.4.1 復合膜抑菌圈實驗[17]

當反常出現后，當自然界以某種方式違反支配常規科學所做的預測后，此時科學共同體成員則會對反常的現象和領域進行一定的研究，以便找出問題所在，通過調整范式來消解這種反常。“發現始于意識到反常，即始于認識到自然界總是以某種方法違反支配常規科學的范式所做的預測。”[2]44由此可見，出現反常現象后，調整范式是關鍵的一步。范式有能力迫使科學共同體成員去處理這種反常，因此，范式不僅僅是被動的被利用的，它也有主動的一面。科學共同體依賴于范式的時候，范式便由被動的狀態變為主動的狀態，由靜態轉變為動態。

取各批次膜材，用打孔機截取3個直徑6 mm圓片，實驗前將圓片在紫外燈下照射10 min；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌使用前連續活化6次，取吸光度值A600約等于0.1的菌液備用；試驗在超凈工作臺進行，每組平行3次，記錄37.5 ℃培養24 h抑菌圈外圈直徑(mm)。

1.3.4.2 抑菌率實驗

抑菌率實驗參照振蕩燒瓶法進行[18]。

1.3.4.3 鮮肉保藏應用

選取當天宰殺未經冷藏冷凍處理新鮮豬肉(純瘦肉)切片，控制厚度在1 cm左右，單面面積約50～70 cm2(需保證膜材能完全覆蓋)，上下面各貼一層復合膜，保證貼合的平整。將復合膜貼合的鮮肉置于塑料保鮮盒內，以保鮮膜封口，4 ℃冷藏儲存。以鮮肉的pH，揮發性鹽基氮、微生物總量來衡量肉品質。保鮮盒和保鮮膜封裝前需要紫外燈下處理30 min，鮮肉封裝在無菌區域進行。

鮮肉pH按國家標準GB/T 9695.5—2008方法測定[19]；鮮肉微生物菌落總數按照GB/T4789.17—2003方法檢驗[20]和GB 47892—2010方法測定[21]；揮發性鹽基氮檢驗采用揮發性鹽基氮快速檢測儀測定，儀器執行標準GB 2707—2005[22]。

1.3.5 數據處理

試驗數據利用Origin Pro 8作圖，數據采用Minitab 17和SPSS 19進行分析。

2 結果與分析

2.1 膜材主要參數

表1 膜材主要參數

注：同列中不同字母表示相關性分析時差異的顯著性(P<0.05)，表2同。

結果表明納米ZnO的加入能降低膜材水分含量，特別是高濃度復合膜表現更明顯，這是由于納米顆粒的加入改善了膜材內部分子聯接狀況，形成了更加致密的網絡結構，不利于水分子在成型過程中的存留；同時由于膜內部分子向規整轉變，添加納米ZnO提高了膜材的透明度。

2.2 紅外光譜

復合膜紅外光譜圖見圖1。

(a)5003；(b)5010；(c)CS圖1 復合膜紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of composite films

復合膜內部不同組分的交聯對膜材的性能有重要影響，同時內部基團的變化是判斷各組分相容性的重要依據，紅外光譜分析可以反映膜材內部各組分之間的交聯和內部基團變化情況[8]。圖中紅外光譜表明殼聚糖主要的吸收峰為900 cm-1處的環伸縮振動吸收峰；1 050 cm-1處的—OH伸縮振動吸收峰；1 170 cm-1的C—O—C氧橋反對稱伸縮；1 380 cm-1處的CH3對稱變形振動吸收峰；1 600 cm-1的N—H面內彎曲振動吸收；1 650 cm-1處的水分子的彎曲振動；3 400 cm-1處的寬—OH和—NH吸收振動寬吸收峰；2 950 cm-1的—CH對稱和反對稱吸收，這與VASEEHARAN[14]和彭勇[23]等的結果基本一致。納米ZnO粉末的紅外圖譜表明納米ZnO表面有大量羥基存在，使得納米ZnO易發生團聚，并能與某些特征基團作用[24-25]。納米ZnO的加入主要引起復合膜吸收峰的變化在500～700 cm-1處的氫鍵吸收由復雜多峰變成單一尖吸收峰；1 500 cm-1左右出現明顯的肩峰吸收；添加3%的納米ZnO在3 400 cm-1左右—OH和—NH吸收峰降低明顯，并發生紅移，說明此處有新的氫鍵生成[6]，分析原因主要是膜中O—Zn—O與殼聚糖內部基團的吸附和振動造成，特別是在含有羥基和氨基的容易形成氫鍵的部位納米ZnO的影響更明顯。

2.3 X射線衍射

復合膜晶體衍射圖見圖2。

(a)CS；(b)5003；(c)5010；(d)ZnO圖2 復合膜晶體衍射圖Fig.2 XRD spectra of composite films

復合膜中添加物質的不同能影響膜材內部的結晶，結晶能提高膜材的透明度和機械性能，利用X射線衍射可以分析膜材內部結晶狀況。結晶分析表明納米ZnO的加入促進了膜材內部由無定型狀態向結晶狀態轉變。空白殼聚糖膜在21°左右出現較弱衍射吸收峰，這與曾少甫[17]和JAYASURIYA[26]的研究結果基本相符；5003復合膜在12.7°、17.6°和23.1°處出現明顯衍射峰；5010復合膜在12.7°和23.1°處出現明顯衍射峰。

2.4 XGT和掃描電鏡

復合膜X射線分析顯微鏡圖和電子顯微鏡圖見圖3。

(1)5003；(2)5010；(a)3% 20 000倍；(b)3% 40 000倍；(c)10% 20 000倍；(d)10% 40 000倍；(e)CS 20 000倍圖3 復合膜X射線分析顯微鏡圖和電子顯微鏡圖Fig.3 XGT and SEM spectra of composite films

XGT分析表明復合膜中鋅元素的分布比較均勻，未在宏觀上出現明顯的空白或過度集中區域。電鏡掃描結果表明50 nm ZnO能與殼聚糖基體較好的融合，沒有明顯的相分離和開裂出現。5010組復合膜中納米顆粒發生了一定的團聚，顆粒變大，團聚影響了膜材的平整性。

2.5 抑菌圈

復合膜抑菌結果見表2。

表2 復合膜抑菌圈

抑菌圈殼聚糖膜本身具有一定的抑菌性，添加納米ZnO能顯著提高膜的抑菌圈效果。綜合2種試驗菌的結果，5003組抑菌圈比5010組更明顯，結合電鏡掃描分析原因是在抑菌圈瓊脂基實驗中高添加濃度復合膜中納米粒子團聚導致納米顆粒在膜材內部和培養瓊脂表面難以釋放并擴散，降低了納米粒子與菌液接觸的幾率，而接觸是納米ZnO抗菌的主要方式[27]。同時抑菌圈實驗表明納米ZnO復合膜對具有代表性革蘭氏陰性菌(E.coli)和革蘭氏陽性菌(S.aureus)都有抑制效果。

2.6 抑菌率

復合膜抑菌率結果見圖4。

圖4 復合膜抑菌率Fig.4 Antibacterial rate of composite films

抑菌率實驗表明殼聚糖膜本身對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用，抑菌率超過80%，這與抑菌圈實驗結果一致。納米ZnO能顯著提高膜的抑菌能力，其中5003和5010組與CS組對比差異明顯(P<0.05)，不同添加量組之間不表現出明顯抑菌差異。抑菌率與抑菌圈結果有一定的差異，原因是利用改良振蕩燒瓶實驗法的過程中膜材中的納米ZnO粒子更容易釋放進入菌液中發揮抑菌作用；復合膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌不表現明顯的抑菌差異，這與JIANG[28]等得到的結果一致。

2.7 鮮肉保藏

復合膜鮮肉保藏結果見表3。

表3 復合膜鮮肉保藏

注：肉包裝前初始數據：pH 5.94；TVB-N 7.23； 菌落總數：6.7×104CFU /g；標準一級鮮肉限定值pH：6.2，TVB-N：15 mg/100g，菌落總數：1×106CFU /g。

分析表3數據，空白殼聚糖膜在鮮肉試驗中能有效控制揮發性鹽基氮和菌落總數的增長，但對鮮肉的pH的控制效果不是很明顯，第4天pH已經達不到鮮肉標準，其它指標能保持到第5天仍不超標；5003和5010組對3個指標均有明顯控制作用，除pH指標在第5天超標外，其他2項指標在第5天仍處于正常鮮肉指標范圍；納米ZnO復合膜對鮮肉中微生物的控制最顯著，兩實驗組在揮發性鹽基氮和菌落總數的控制上不表現明顯差異。實驗結果表明在作為襯墊層的鮮肉冷藏實驗中復合膜對鮮肉的鮮度控制有顯著的作用，能延長鮮肉鮮度期至少2 d；5010復合膜在該試驗中效果沒有明顯優于5003復合膜，這可以為節省納米ZnO的使用提供參考。

3 結論

不同添加濃度50 nm ZnO在殼聚糖膜中宏觀上分布均勻，微觀上不引起內部相分離和開裂。納米ZnO能與殼聚糖分子內部官能團發生相互作用，促進了殼聚糖內部分子由無序向部分結晶狀態轉變，從而促進復合膜性能的提升。復合膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現出強的抑制作用；復合膜抑菌圈實驗中，3%添加濃度的復合膜抑菌圈試驗效果優于10%高添加濃度復合膜，而在振蕩法抑菌試驗中濃度為10%的添加濃度復合膜抑菌率明顯高于3%添加濃度復合膜，這表明復合膜材抑菌性能的提升一定程度上依賴于膜材中納米顆粒的釋放和擴散。

膜材作為內包裝襯墊，能在冷藏條件下很好控制鮮肉的揮發性鹽基氮值和菌落總數值，不同添加濃度復合膜對豬肉保鮮無明顯差異，所以在復合膜實際應用配方設計中，可以選擇較低濃度來設計制作膜材，減少納米ZnO的用量。

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The property of nano-ZnO/chitosan composite film and its application in chilled fresh pork preservation

KUANG Heng-feng1, HU Chang-ying2, 3*, WEN Xiao-min2, LYU Jing-quan2

1(Packaging Engineering Institute of Jinan University, Zhuhai 519070, China) 2(Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China) 3(Key Laboratory of Product Packaging and Logistics of Guangdong Higher Education Institutes, Zhuhai 519070, China)

Nano zinc oxide (50 nm) at different concentration 10% and 3%(w/w, ZnO/Chitosan)were mixed with chitosan to prepare the composite film by solution casting method. The functional groups, the crystallinity and morphology were tested using FTIR, XRD and SEM, XGT. The inhibition zone and antibacterial rate method were used to testing the antibacterial activity. At last, the composite films were applied as the pad in fresh pork packaging at 4 ℃. The results showed that Nano zinc oxide improved the crystallinity of composite film dramatically, and Nano zinc oxide could well dissolve in chitosan matrix. The inhibition zone test showed that chitosan film had antibacterial againstE.coliandS.aureus, and Nano zinc oxide could increase the inhibition zone, especially at lower concentration. The antibacterial rate for composite film was 93%, 10% increase than the control film. The composite film controlled TVB-N and CFU number in fresh pork’s very well.

chitosan; Nano zinc oxide; composite antibacterial film; pork preservation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704040

碩士研究生(胡長鷹教授為通訊作者，E-mail：hucy0000@sina.com)。

國家自然科學基金(31571762)

2016-07-13，改回日期：2016-09-20