豬繁殖與呼吸綜合征病毒烏魯木齊分離株GP5基因遺傳變異分析

蔡擴軍 ， 李愛巧 ， 何 生 ， 楊啟元 ， 韓義忠 ， 陳發喜 ， 梁望旺

(1. 烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心 ， 新疆烏魯木齊830063 ； 2. 烏魯木齊市米東區畜牧獸醫站 ，新疆烏魯木齊831400 ； 3.烏魯木齊市米東區三道壩畜牧獸醫站 ， 新疆烏魯木齊831403 ；4. 重慶市動物疫病預防控制中心 ， 重慶渝北401102)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒烏魯木齊分離株GP5基因遺傳變異分析

蔡擴軍1， 李愛巧1， 何 生2， 楊啟元1， 韓義忠3， 陳發喜1， 梁望旺4

(1. 烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心 ， 新疆烏魯木齊830063 ； 2. 烏魯木齊市米東區畜牧獸醫站 ，新疆烏魯木齊831400 ； 3.烏魯木齊市米東區三道壩畜牧獸醫站 ， 新疆烏魯木齊831403 ；4. 重慶市動物疫病預防控制中心 ， 重慶渝北401102)

為對烏魯木齊市豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的分子遺傳變異情況進行研究與分析，應用RT-PCR方法對疑似感染PRRSV豬的組織臟器進行PRRSV GP5基因的擴增，將陽性樣品PCR產物進行克隆和測序，并應用分子生物學軟件對測序結果進行比對和遺傳進化分析。結果顯示,5株病毒分離株GP5基因全長均為603 bp，與JXA1株親緣關系較近，同屬于美洲株的同一基因亞群。本試驗結果為掌握烏魯木齊市PRRSV的分子遺傳變異情況提供了依據。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒 ； GP5基因 ； 遺傳變異

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，是由豬繁殖PRRSV引起的一種高度接觸性急性傳染病。主要引起懷孕母豬的繁殖障礙以及仔豬的呼吸系統疾病，對幼齡仔豬具有較強的致病性和較高的病死率。該病自1987年首次在美國發現，其后在世界各主要養豬國家廣泛流行，目前該病已成為危害養豬業發展的主要病毒性疾病之一[3]。

PRRSV易發生變異，其中GP5是變異最大的結構蛋白[1-2]。因此，GP5基因的變異情況在一定程度上反應了PRRSV整個基因組序列的變異情況。本文通過對烏魯木齊市PRRSV流行毒株的ORF5基因序列進行測序，并跟國內外代表毒株進行比對分析，以期為該地區PRRS防制提供必要的分子流行病學信息。

1 材料與方法

1.1 病料樣品 疑似感染PRRSV豬的肺、淋巴結、扁桃體等組織病料。

1.2 主要試劑 病毒核酸純化試劑盒、RT-PCR一步法試劑盒，購自TaKaRa公司。

1.3 引物設計 上游引物：5'-CCCGTTGGAATGGTACTCCTCAACTG-3'；下游引物：5'-CGGGGTCTGAT TGCTGGTAATCAGAAT-3'。預計擴增目的片段大小773 bp。

1.4 GP5基因的擴增與測序 參照病毒核酸純化試劑盒說明書對PRRSV陽性組織樣品的總RNA進行提取。按照RT-PCR一步法試劑盒對提取的RNA進行RT-PCR擴增，將PCR陽性產物進行測序。

1.5 基因序列遺傳進化分析 應用GenBank Blast和DNAStar生物學分析軟件對擴增的核苷酸序列進行分析，并與GenBank中登錄的PRRSV GP5基因序列和推導的氨基酸序列進行同源性比較，利用和Mega6.0軟件繪制系統進化樹。

2 結果

2.1 目的基因的擴增結果 用RT-PCR法從9份疑似感染PRRSV的樣品中擴增出5份與預期片段大小相符的特異性片段，擴增結果見圖1。

圖1 分離毒株ORF5 基因的擴增

M：DL-1 000 DNA Marker； 1-3，9：擴增陰性； 4-8：擴增陽性； 10：陽性對照； 11陰性對照

2.2 目的基因的序列測定結果 送去測序的5株GP5基因全長均為603 bp，編碼201個氨基酸，登錄NCBI 利用Blast對測序結果進行分析，結果表明，擴增得到的5條序列為PRRSV 0RF5基因序列，命名為WLMQ-1-5株。

2.3 PRRSV GP5基因核苷酸與氨基酸序列同源性對比分析 將本試驗從陽性樣品擴增出的5株PRRSV GP5基因與GenBank上國內外已發表的15株PRRSV GP5基因序列進行同源性分析比較，比對結果見圖2和圖3。

圖2 分離株ORF5 基因核苷酸同源性比較

圖3 分離株ORF5 基因編碼氨基酸同源性比較

2.4 PRRSV ORF5序列遺傳進化關系 將烏魯木齊市5株PRRSV GP5基因序列與GenBank上國內外已登錄的15株PRRSV GP5基因構建遺傳進化樹(圖4)，結果顯示，本試驗測序鑒定的病毒分離株與歐洲株LV親緣關系最遠，與經典PRRSV毒株BJ-4株、VR2332株親緣關系較遠，與以PRRSV JXA1株為代表的國內其他幾株分離毒株在同一個分支上，說明親緣關系最近，屬于美洲株(Type 2)同一亞群。說明所分離的毒株可能由國內流行毒株進化而來。

圖4 PRRSV ORF5序列遺傳進化關系

3 討論

PRRSV屬于有囊膜RNA病毒，歸屬套式病毒目(Nidovirales)，動脈炎病毒科(Arteriviridae)，動脈炎病毒屬(Arterivirus)，基因組約為15 kb，包括ORFla、ORFlb、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5、ORF6和ORF710個開放性閱讀框(ORF)[3-5]。由ORF5編碼的GP5糖蛋白是該病毒主要的免疫原性結構蛋白之一，具有良好的抗原性，在病毒吸附和進入宿主細胞過程中發揮作用，能引起機體產生具有保護作用的有效免疫應答。該糖蛋白內含一段中和病毒的區域和作為病毒最保守區前導序列的2個糖基化位點，對受體具有識別作用，同時具有誘導細胞凋亡的功能。PRRSV的GP5研究表明，豬感染PRRSV后，ORF5基因的多個位點在病毒增殖過程中具有較高的變異率，是目前PRRSV的遺傳變異分析和基因進化樹的構建主要依據[6-8]。PRRSV同其他有囊膜的RNA病毒一樣，自然選擇壓力導致基因組變異率極高，造成疫苗免疫失敗，從而造成疫病的反復流行。因此預防該病的主要方法之一就是選擇當地流行毒株作為疫苗背景進行免疫。

本試驗烏魯木齊5個分離株與美洲型JXA1遺傳關系較近，可歸屬同一基因亞群，這有利于烏魯木齊市PRRS 的凈化。理論上以美洲型JXA1株或HPRRSV毒株制成的弱毒疫苗和滅活苗，其免疫保護力應高于RespPRRS MLV 疫苗和CH-1a 滅活苗。但相比滅活苗，弱毒苗能夠刺激機體產生更高的中和抗體，從而提供更好的保護[9]，但要注意弱毒疫苗的回復突變導致毒力返強[10]。同時，本試驗也在一定程度上反應了PRRSV的同源性與其在空間上的分布或時間上的差異存在較強的對應關系。

[1] Key K F, Haqshenas G, Guenette D K,etal. Genetic variation and phylogenetic analyses of the ORF5 gene of acute porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates[J]. Vet Microbiol, 2001, 83(3):249-263.

[2] Chen J, Liu T, Zhu C G,etal. Genetic variation of Chinese PRRSV strains based on ORF5 sequence[J]. Biochem Genet, 2006, 44(9-10):425-435.

[3] Conzelmann K K, Visser N, Van Woensel P,etal. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group[J]. Virology, 1993, 193(1):329-339.

[4] Neumann E J, Kliebenstein J B, Johnson C D,etal. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States[J]. J Am Vet Med Assoc, 2005, 227: 385-392.

[5] Stadejek T, Stankevicius A, Storgaard T,etal. Identification of radically different variants of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus in Eastern Europe: towards a common ancestor forEuropean and American viruses[J]. J Gen Virol, 2002, 83: 1861-1873.

[6] Liu J K, Wei C H, Yang X Y,etal. Genetic diversity and evolutionary characterization of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses based on NSP2 and ORF5[J]. Arch Virol, 2013, 158: 1811-1816.

[7] 石娜, 尹杰超, Dante Z, 等. 豬IL-15與PRRS病毒GP5基因核酸疫苗免疫效力[J]. 東北農業大學學報, 2010, 41(1): 97-102.

[8] Itou T, Tazoe M, Nakane T,etal. Analysis of open reading frame 5 in Japanese porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates by restriction fragment length polymorphism [J]. J Vet Med Sci, 2001, 63(11):1203-1207.

[9] Zuckermann F A, Garcia E A, Luque I D,etal. Assessment of the efficacy of commercial porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccines based on measurement of serologic response, frequency of gamma-IFN-producing cells and virological parameters of protection upon challenge[J]. Vet Microbiol, 2007, 123(1-3):69-85.

[10] 梁望旺, 楊克禮, 伍銳, 等. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒分離株GP5 基因的遺傳變異與系統進化分析[J]. 華中農業大學學報, 2009, 28(5): 595-599.

Genetic variation and phylogenetic analysis of glycoprotein 5 gene of pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus inUrumqi

CAI Kuo-jun1, LI Ai-qiao1, HE Sheng2, YANG Qi-yuan1, HAN Yi-zhong3, CHEN Fa-xi1, LIANG Wang-wang4

(1.Urumqi Animal Disease Control and Diagnosis Center, Urumqi 830063, China; 2. Animal Husbandry and Veterinary Station of Midong District of Urumqi, Urumqi 831400, China; 3.Animal Husbandry and Veterinary Station of Sandao ba District of Urumqi，Urumqi 831403，China；4. Chongqing Animal Disease Prevention and Control Centre, Chongqing 401102, China)

To study and analyze the molecular genetic variations of pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) in Urumqi, the GP5 genes of suspected PRRSV positive samples were amplified by RT-PCR.PCR products of positive samples were cloned and sequenced．The results of alignment analysis showed that all the full length of GP5 from 5 isolates was 603bp, and they were closely related to the JXA1strain and belonged to the same subgroup. This study would provide the basis for mastering the molecular genetic variation of PRRSV in Urumqi．

porcine reproductive and respiratory syndrome virus; GP5 gene; variation and phylogenetic

LI Ai-qiao

2016-07-07

新疆維吾爾自治區科技廳科技援疆項目(201491165)；烏魯木齊市科技局應用開發研究計劃(Y141210013)

蔡擴軍(1985-)，男，獸醫師，碩士，主要從事動物疫病診療工作，E-mail：caikuojun@163.com

李愛巧，E-mail：laq4616369@126.com

S852.65

A

0529-6005(2017)05-0020-03