兩株氫噬胞菌的萘降解特性分析

孟建宇，李 蘅，唐 凱，宋凱凱，馮福應

（內蒙古農業大學 生命科學學院應用與環境微生物研究所，內蒙古 呼和浩特 010011）

兩株氫噬胞菌的萘降解特性分析

孟建宇，李 蘅，唐 凱，宋凱凱，馮福應

（內蒙古農業大學 生命科學學院應用與環境微生物研究所，內蒙古 呼和浩特 010011）

對兩株分離自內蒙古烏梁素海的氫噬胞菌X32和X12的培養條件和萘降解特性進行研究。實驗結果表明：菌株X32和X12的最適生長pH為7.0，最適生長溫度為30～35 ℃，最適鹽度w（NaCl）為1%；當初始萘質量濃度為3 500 mg/L時，對數生長期的菌株X32對萘的降解活性可達53.9 nmol/（mg·min），而菌株X12可達34.8 nmol/（mg·min）；菌株X32在培養48 h后進入穩定期，60 h時萘降解率達91.43%；菌株X12在培養60 h后進入穩定期，90 h時萘降解率達93.93%。氫噬胞菌X32和X12是兩株具有較高應用價值的多環芳烴降解細菌。

氫噬胞菌；多環芳烴；萘降解菌；生長條件；降解特性

多環芳烴（PAHs）廣泛分布于大氣、水體和土壤中，由其造成的污染給生態環境和人類健康帶來很大的潛在危害［1-3］。大量的研究證明，在諸多方法中，生物降解法是去除環境中PAHs 的最主要途徑［4］。微生物是PAHs降解最主要和最重要的生物類群，以微生物降解和轉化為基礎的生物修復技術則是解決PAHs污染問題的重要手段［5-6］。因此，PAHs污染的微生物修復技術一直是國內外科學家們的研究熱點［7］。

萘是PAHs中分子量最小且結構最為簡單的物質，是進行PAHs降解研究的常用典型化合物［8］。目前，以萘作為唯一碳源分離得到的菌種主要包括產堿桿菌屬（Alcaligenes sp.）、伯克氏菌屬（Burkholderia sp.）、分支桿菌屬（Mycobacterium sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、勞爾氏菌屬（Ralstonia sp.）、紅球菌屬（Rhodococcus sp.）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas sp.）、鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）和細桿菌屬（Microbacterium sp.）等［9-12］。新的高效降解菌株的篩選和研究相對不足［13-15］，因此探尋具有較高降解活性的優良菌種在PAHs的環境治理方面就顯得格外重要［16］。而可降解PAHs的氫噬胞菌屬（Hydrogenophaga sp.）的菌株發現極少，僅見1株由宋昊等［5］分離到的萘降解菌H. Palleronii LHJ38。

本工作考察了分離自內蒙古烏梁素海的兩株氫噬胞菌（Hydrogenophaga sp.）的生長特性和萘降解能力，為合理有效利用微生物去除PAHs有害物質提供了高效穩定的菌種來源。

1 實驗部分

1.1 試劑和材料

環己烷（分析純）、Folin-酚試劑：購自美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

萘降解菌實驗菌種：兩株氫噬胞菌Hydrogenophaga sp. X32和Hydrogenophaga sp. X12（簡稱菌株X32和X12），由內蒙古農業大學應用與環境微生物研究所分離自內蒙古自治區巴彥淖爾市烏拉特前旗烏梁素海。

微量元素溶液（TES）：FeCl30.05 g，H3BO30.01 g，MnSO4·H2O 0.02 g，CuSO4·5H2O 0.01 g，（NH4）6Mo7O24·4H2O 0.02 g，ZnSO40.01 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，乙二胺四乙酸（EDTA） 0.5 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0。

菌株活化培養基：MgSO4·7H2O 0.1 g，酵母粉 2 g，K2HPO40.2 g，NaCl 5 g，TES 1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

無機鹽液體培養基：Na2HPO49.0 g，KH2PO41.5 g，NH4Cl 2.0 g，CoCl2·6H2O 15.3 mg，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·7H2O 3.0 mg，ZnSO4·7H2O 0.2 mg，蒸餾水1 000 mL， pH 7.0。碳源萘的添加：用少量丙酮完全溶解實驗所需用量的萘，將其滴加至滅菌后的無機鹽液體培養基中，加蓋密封。

1.2 生長曲線和萘降解曲線的測定

將菌株X32和X12的單菌落分別接種至多個含30 mL萘初始質量濃度為3 500 mg/L的無機鹽液體培養基的錐形瓶中，在30 ℃、pH=7.0、搖床轉速180 r/min條件下振蕩培養，定時取樣，測定培養液在650 nm處的吸光度（A650，此值與菌液濃度成正比，可間接表示菌生長量），計算萘的質量濃度。

1.3 最適生長條件的確定

分別考察菌株X12和X32的最適生長pH，最適生長鹽濃度和最適生長溫度。每個梯度3個平行樣，于搖床轉速180 r/min條件下振蕩培養，定時取樣，測定培養液的A650。

1.4 萘降解活性的測定

將菌株X32和X12的培養液離心分離，收集菌體，制成每毫升含1 mg濕菌體的菌懸液。取200 μL萘質量濃度為3 500 mg/L的萘-丙酮溶液溶于30 mL無機鹽液體培養基中，接種100 μL菌懸液，立刻用硅膠密封管口，在最適培養條件下振蕩3 h。取4mL培養液，加入0.4 mL濃度為1 mol/L的鹽酸，終止反應。用4 mL環己烷萃取培養液中剩余的萘，測定萃取液在275 nm處的吸光度（AM）。同時，用4 mL環己烷對4 mL無機鹽液體培養基（作為空白）進行萃取，測定萃取液在275 nm處的吸光度（A0）。菌株X32和X12對萘的降解活性（ξ）定義為單位質量的菌體（以蛋白質含量計）在單位時間內降解萘的物質的量［5］，單位為nmol/（mg·min），計算公式見式（1）。

式中，VEXM為環己烷的體積，mL；VCS為菌懸液的體積，mL；k為萘在本實驗條件下的摩爾吸光系數，1.260 3×102L/（mol·cm）；1為比色皿光程長度，cm；ρpro為菌懸液中蛋白質的質量濃度，mg/ mL；t為反應時間，min。

1.5 分析方法

菌液中蛋白質含量的測定采用Folin-酚試劑法［17］。

萘質量濃度的測定：以環己烷為參比，測定含不同濃度萘的環己烷萃取液在275 nm處的吸光度。在所選擇的萘濃度（c，mmol/L）范圍（0～0.3mmol/L）內，萘濃度與其相應的吸光度（A）呈直線關系，回歸方程為A=0.1260 3c，得出萘在環己烷中的摩爾吸光系數為1.260 3×102L/（mol·cm）。降解液中加入等體積環己烷，劇烈振蕩30 min，相分離后用適量環己烷適當稀釋萃取液，在275 nm處以環己烷為參比測定其吸光度，計算反應液中萘的濃度，并折算成萘的質量濃度。

2 結果與討論

圖1 菌株X32和X12的生長曲線

2.1 生長曲線

菌株X32和X12的生長曲線見圖1。由圖1可見：菌株X32的延滯期為0～12 h，12 h后進入對數生長期，48 h 后進入穩定期；菌株X12的延滯期為0～24h，24 h后進入對數生長期，60 h 后進入穩定期。

2.2 最適生長條件

pH、溫度和鹽度（w（NaCl），%）對菌株X32和X12生長的影響分別見圖2～4。由圖2可見，菌株X32和X12在pH 6.5～8.5都可生長，pH 7.0時生長最好，為最適生長pH，與已報道的多數萘降解菌［10，15-16，18-20］相同，但與菌株H. Palleronii LHJ38（最適pH 6.6）［5］有所不同。由圖3可見，30～35 ℃為兩株菌的最適生長溫度范圍，這與多種萘降解菌［15-16，18，20］類似，但也與菌株H. Palleronii LHJ38（最適溫度28 ℃）［5］有所不同。由圖4可見：兩菌株在鹽度小于2%時，生長良好；鹽度為1 %時，生長最好，有一定的耐鹽性；當鹽度達到3%時，生長受到極大的抑制。

圖2 pH對菌株X32和X12生長的影響

圖3 溫度對菌株X32和X12生長的影響

圖4 鹽度對菌株X32和X12生長的影響

2.3 萘降解曲線及降解活性

在最適條件下，菌株X32和X12對萘的降解曲線見圖5。

圖5 菌株X32和X12對萘的降解曲線

由圖5可見：兩菌在延滯期的萘降解率均極低，而當細菌進入對數生長期時，即細菌生長速率最快時，萘降解率快速增加；進入穩定期后，兩菌的降解曲線出現拐點，菌株X32在培養60 h時萘降解率達91.43%，隨后增長趨緩；菌株X12在培養90 h時萘降解率達93.93%，隨后增長趨緩。經計算，菌株X32在對數生長期（培養12～48 h）時對萘的降解活性達53.9 nmol/（mg·min），高于菌株H. PalleroniiLHJ38的萘降解活性（47.3 nmol/（mg·min））［5］，而菌株X12在對數生長期（培養24～60 h）時對萘的降解活性達34.8 nmol/（mg·min）。

3 結論

a）氫噬胞菌Hydrogenophaga sp. X32的生長延滯期為0～12 h，12～48 h為對數生長期，48 h后進入穩定期；氫噬胞菌Hydrogenophaga sp. X12的生長延滯期為0～24 h，24～60 h為對數生長期，60 h后進入穩定期。

b）菌株X32和菌株X12的最適培養條件為：pH 7.0，生長溫度30～35 ℃，鹽度1%。

c）在對數生長期時，菌株X32和X12對初始質量濃度為3 500 mg/L的萘的降解活性分別達53.9 nmol/（mg · min）和 34.8 nmol/（mg· min）；進入穩定期后，菌株X32在培養60 h時萘降解率達91.43%，菌株X12在培養90 h時萘降解率達93.93%。因此，菌株X32和X12是兩株具有很高多環芳烴（PAHs）污染治理應用價值的細菌。對其降解性能和降解機制的深入研究，可為PAHs的微生物修復提供新的可行性途徑。

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（編輯 葉晶菁）

Analysis on naphthalene degradation characteristics of two Hydrogenophaga sp. strains

Meng Jianyu，Li Heng，Tang Kai，Song Kaikai，Feng Fuying
（Institution of Applied and Environmental Microbiology，College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot Inner Mongolia 010011，China）

The culture conditions and naphthalene degradation characteristics of Hydrogenophaga sp. X32 and Hydrogenophaga sp. X12，which were isolated from Wuliangsuhai Lake of Inner Mongolia，were studied. The experimental results showed that：The optimal growth pH value was 7.0，the optimal growth temperature was 30-35℃ and the optimal salt concentration was 1%；When the initial naphthalene mass concentration was 3 500 mg/L，the naphthalene-degrading activity of X32 in logarithmic growth phase was 53.9 nmol/（mg·min），while that of X12 was 34.8 nmol/（mg·min）；After 48 h of cultivation，the strain X32 was in steady growth phase，and the naphthalene degradation rate was 91.43% in 60 h；After 60 h of cultivation，the strain X12 was in steady growth phase，and the naphthalene degradation rate was 93.93% in 90 h. Hydrogenophaga sp. X32 and Hydrogenophaga sp. X12 were two PAHs-degrading bacterial strains with high application value.

Hydrogenophaga sp.；polycyclic aromatic hydrocarbon；naphthalene-degrading bacteria；growth condition；degradation characteristics

X172

A

1006-1878（2017）03-0300-04

10.3969/j.issn.1006-1878.2017.03.008

2016 - 10 - 08；

2017 - 02 - 17。

孟建宇（1977—），男，內蒙古自治區烏蘭察布市人，碩士，副教授，電話 0471 - 6508315，電郵 meng_jianyu@ imau.edu.cn。聯系人：李蘅，電話 0471 - 6508315，電郵liheng0123@sina.com。

國家自然科學基金項目 （31460002，31560030）；內蒙古自治區自然科學基金項目 （2015MS0355）；內蒙古自治區高等學校科學研究項目 （NJZY14084）。