嗅鞘細胞移植與α晶體蛋白聯合對大鼠視神經損傷后視功能恢復的促進作用

王艷華，王東武

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嗅鞘細胞移植與α晶體蛋白聯合對大鼠視神經損傷后視功能恢復的促進作用

王艷華1，王東武2

目的 研究嗅鞘細胞(olfactory ensheathing cells, OECs )移植與α晶體蛋白聯合對大鼠視神經損傷后視功能恢復的促進作用。方法 玻璃體腔α晶體蛋白注射，聯合視神經損傷近端移植OECs，分為4個實驗組，包括α晶體蛋白注射組、OECs移植組、α晶體蛋白注射+OECs移植組、PBS對照組。于視神經損傷并移植OECs+玻璃體腔注射藥物后即刻、1周、2周、1個月、2個月、3個月，用全自動眼電生理儀進行閃爍視覺誘發電位(flash-elicited visual-evoked potential，FVEP)檢測，分析比較各時間點各組P1波的振幅及潛時。結果 OECs移植組及α晶體蛋白注射+OECs移植組FVEP的P1波振幅于視神經損傷后1周[(8.49±1.19)μv, (9.33±2.54)μv]、2周[(8.85±1.92)μv，(9.43±2.41)μv]、1個月[(8.46±1.09)μv，(8.72±1.91)μv]、2個月[(8.12±1.41)μv，(8.48±1.67)μv]、3個月[(7.68±2.56)μv，(8.08±1.47)μv]，均顯著高于對照組(P<0.01)，二者聯合組P1波振幅恢復更為明顯。3個實驗組FVEP的P1波潛時與對照組比較，均無統計學差異。結論 OECs移植與α晶體蛋白均明顯促進視神經損傷后FVEP電生理的恢復，其中，二者聯合的作用最為明顯。

α晶體蛋白；嗅鞘細胞；視神經損傷修復

嗅鞘細胞(olfactory ensheathing cells，OECs)及其伴隨的嗅神經纖維細胞(olfactory nerve fibroblasts，ONFs)移植，可明顯促進脊髓及視神經損傷后神經的再生[1, 2]，但是視網膜神經節細胞(Retinal ganglion cells, RGCs)的神經纖維離開移植的OECs/ONFs形成的“髓鞘樣”通道后，難以繼續再生，更不能實現長距離再生到達視中樞[2]。玻璃體腔注射α晶體蛋白，也能促進視神經損傷后RGCs存活和軸突再生[3-5]，但是在視神經損傷后1個月促進再生作用基本消失[3]。筆者前期的研究發現，OECs移植聯合α晶體蛋白能更有效地促進視神經再生[6]，但對視功能的修復尚缺乏研究。本實驗通過大鼠視神經損傷后FVEP檢測，研究OECs移植聯合α晶體蛋白對視神經損傷后視功能的修復作用，進而為神經損傷和再生的基礎研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 成年(250～300 g)Long Evans大鼠，雌雄不限。由第三軍醫大學實驗動物中心提供，符合國家醫用動物使用標準，標準號為清潔級，檢證字SCXK(渝)20020003。

1.2 細胞培養及鑒定 參照文獻[7]進行OECs/ONFs培養。取成年Long Evans大鼠(體重250～300 g)斷頸處死，取出嗅球，取嗅神經層和外顆粒層用0.125%胰酶消化15 min，37 ℃。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液終止消化，加入0.5%DNAse，吸管吹打10次后，1000 r/min，離心5 min。棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液，輕輕吹打成單細胞懸液，接種至L-多聚賴氨酸包被的6孔培養板中，37 ℃恒溫培養箱培養。第5天首次換液，余每3 d換液。培養第14天，細胞密度達1.5×106。參照文獻[6,8]分別用兔抗大鼠S-100單抗 (1∶200, Sigma, 美國)鑒定OECs，小鼠抗大鼠纖維連接蛋白鑒定ONFs(1∶200, Santa Cruz Biotechnology, 美國)。二抗為山羊抗小鼠IgG-FITC和山羊抗兔IgG-cy3 (Boster, 中國)。

1.3 大鼠視神經鉗夾傷模型制作及實驗分組 參照文獻[4]進行視神經夾傷及注射。每組6只，共24只實驗大鼠用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，固定于手術臺，手術顯微鏡下剪開大鼠手術眼上穹隆結膜約120°，避開渦靜脈，鈍性分離暴露視神經，在眼球后1 mm處，用11號尖刀沿視神經縱軸方向縱行挑開視神經鞘膜長4～5 mm，避免損傷視神經，用中號無創血管夾在球后2 mm處鉗夾視神經10 s，鉗夾傷后即刻，在夾傷近端，用35 G的NF35BV-2針頭垂直視神經注射OECs(濃度1×106/ml)單細胞懸液或0.01 M的PBS，注射量3 μl，注射速度要緩慢，約40 s注完，注射結束后，留針2 min再拔針。術后載玻片輕壓角膜，鏡下觀察眼底，無缺血者納入實驗。α晶體蛋白(10-4g/L，5 μl)或PBS(0.01 M,5 μl)用10μl的微量進樣器于距離視乳頭約2 mm的鞏膜壁上，垂直于視神經縱軸刺入玻璃體腔。術畢分層縫合。術后大鼠術眼涂托百士眼膏，送西南醫院動物所飼養。實驗分為4組：(1)OECs移植+α晶體蛋白注射組；(2)OECs移植組；(3)α晶體蛋白注射組；(4)PBS對照組。

1.4 FVEP電生理檢測視神經功能 于視神經損傷前、視神經損傷并移植OECs+玻璃體腔注射藥物后即刻、1周、2周、1個月、2個月、3個月進行FVEP檢測。電生理檢查參照臨床視覺電生理標準[9]，大鼠用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，安放電極(記錄電極置于枕后隆凸皮下，參考電極置于雙眼連線中點皮下，接地電極置于鼠尾皮下)，暗適應5 min，采用全視野刺激球白色閃光刺激，記錄FVEP。應用RETI-port 軟件測量潛伏期和幅值。每組6只大鼠，共24只大鼠。

2 結 果

2.1 OECs培養 培養的細胞主要由S100陽性的細胞和fibronectin陽性的細胞構成。S100陽性的細胞呈梭形，或三角形，稱其為雪旺樣細胞；而fibronectin陽性細胞為扁平，不規則形，稱其為星形樣細胞，兩者相互交錯混合生長，無明顯分界。培養2周時，兩者之間的數目比例約為1∶1(圖1)。

圖1 大鼠嗅鞘細胞培養2周形態

A.相差×200；B. S100, fibronectin染色，S100為紅色，fibronectin為綠色。標尺50 μm

2.2 OECs與α晶體蛋白聯合對視功能修復的影響 手術前，大鼠FVEP可見明顯穩定的P1波(圖2A)。視神經損傷同時進行OECs損傷局部移植及α晶體蛋白注射后，P1波變得低平，潛時延遲(圖2B，表1)。術后7 d、14 d，OECs、α晶體蛋白及二者聯合組P1波振幅明顯恢復(P<0.01)，而對照組無明顯恢復(圖2C、D，表1)。術后1個月，3個實驗組P1波振幅較損傷14 d有所下降，但與對照組相比仍有統計學差異(P<0.05) (圖2E，表1)。術后3個月，3個實驗組P1波振幅進一步降低，特別是α晶體蛋白組P1波振幅下降更為明顯，與對照組比較，差異無統計學意義，但OECs組及二者聯合組與對照組相比仍有統計學差異(P<0.01) (圖2F，表1)。術后各時間點，3個實驗組P1波潛時較術前均明顯延遲，且與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05，表1)。

指標例數0h7d14d1個月2個月3個月P1波振幅(μv) OECs組64．6±1．38．5±1．2②8．8±1．9②8．5±1．1②8．1±1．4②④7．7±2．4②③ OECs+晶體蛋白組64．5±1．79．3±2．5②9．4±2．5②8．7±1．9②③8．5±1．7②④8．1±1．5②④ 晶體蛋白組64．3±2．08．3±2．6②8．3±2．6①6．6±1．2①5．2±1．44．9±1．8 PBS組64．4±1．34．8±1．75．1±1．94．2±2．24．4±1．34．4±1．3P1潛伏期(ms)OECs組6100．4±13．097．5±10．196．3±15．795．0±19．5121．8±10．8101．6±9．5 OECs+晶體蛋白組6102．9±10．998．4±11．6101．7±7．697．3±12．3114．6±15．5103．2±14．6 晶體蛋白組6104．9±11．199．5±11．991．3±13．989．8±11．9104．3±17．1105．8±16．9 PBS組6102．4±10．3102．7±12．195．0±16．098．6±20．9121．8±15．2113．5±15．9

注：與PBS組比較，①P<0.05，②P<0.01；與晶體蛋白組比較，③P<0.05，④P<0.01

圖2 視神經損傷同時行OECs移植、α晶體蛋白注射術前、術后各組FVEP波形

A.術前；B.術后當天；C.術后7 d；D.術后14 d；E.術后1個月；F.術后3個月

3 討 論

OECs是嗅覺系統中特殊的膠質細胞，可分泌神經生長因子、腦源性神經營養因子、膠質細胞源性生長因子、睫狀神經營養因子等多種營養因子[10]，對眾多中樞神經元及RGCs具有保護和促進神經再生的作用，為治療脊髓和視神經的損傷提供了新的希望[2, 10-12]。雖然與脊髓損傷一樣，視神經損傷局部OECs/ONFs移植同樣使膠質發生重朔，并形成“髓鞘樣”通道，保護神經再生到損傷遠端，但是與脊髓損傷所不同的是，再生的RGCs軸突在離開OECs形成的“髓鞘樣”通道進入損傷遠端后，末端形成囊樣膨大而不能到達靶中樞[2]，說明單純OECs/ONFs移植存在局限性。具有熱休克蛋白功能的α晶體蛋白，不僅能保護視網膜色素上皮細胞、光感受器細胞及晶體上皮細胞的存活[13, 14]；而且對視神經損傷后RGCs的存活也具有顯著的保護作用，RGCs存活率在視神經損傷后14 d可達95%[5]。此外，α晶體蛋白還具有明顯的促進視神經再生的作用，玻璃體腔注射α晶體蛋白后，再生的軸突數比注射牛血清白蛋白組顯著增多，且這一作用持續到視神經損傷后4周[3]。其機制是通過抑制軸突再生抑制物信號傳導的共同作用點——RhoA的激活，干擾RhoA/Rock信號通路、防止生長錐的萎縮而促進軸突再生[4]。雖然α晶體蛋白能保護RGCs存活，并促進軸突再生，但在視神經損傷后4周其作用明顯減弱，并且再生軸突只達到損傷區遠端5 mm，沒有實現長距離再生[3]，說明單純應用α晶體蛋白也存在局限性。筆者最近的研究已證明，OECs移植聯合α晶體蛋白能更有效的促進視神經再生[6]，但對視功能的修復尚缺乏研究。本實驗通過大鼠視神經損傷后FVEP檢測，研究OECs移植聯合α晶體蛋白對視神經損傷后視功能的修復作用。

FVEP 是視網膜受到閃光刺激后產生的視覺電生理活動，反映RGCs至視皮層的信息傳遞及視皮層的電生理活動。主要以P1波的潛伏期及振幅為分析依據，潛伏期反映視神經髓鞘功能，視神經損傷時，發生脫髓鞘改變，傳導速度明顯減慢，表現為潛伏期延遲。振幅主要反映視神經視網膜接受光刺激的功能，并與靶中樞形成突觸的數目有關，視神經損傷時，神經束內壓力增高，神經纖維水腫，軸索傳遞視覺信息及運輸營養因子的功能降低，表現為振幅降低[15, 16]。通過FVEP檢測視功能情況，具有客觀、無損傷、靈敏性好的特點。Sabel[17]研究結果說明，有10%的RGCs存活，就具備使視功能恢復的能力。Chow[18]和Galambos等[19]也證明，2%～3%的視神經纖維與外膝體存在突觸聯系，就能夠具有較好的視功能。Hubel和Wiesel[20]發現，有1%的細胞存在反應，就能夠產生一定的功能恢復。本實驗結果發現，OECs移植、α晶體蛋白玻璃體腔注射，以及兩者聯合組，P1振幅于視神經損傷后7 d即有明顯的恢復，OECs移植組及OECs與α晶體蛋白聯合組，P1振幅恢復情況于視神經損傷后3個月仍非常顯著，但α晶體蛋白組于視神經損傷后2個月P1振幅較損傷1周、2周及1個月下降明顯，這可能與α晶體蛋白單次注射，保護RGCs存活及促進視神經再生作用持續短暫有關。與OECs移植組及α晶體蛋白組比較，各時間點OECs與α晶體蛋白聯合組P1振幅恢復情況均最為顯著，提示，OECs與α晶體蛋白聯合能更有效地促進損傷視神經的功能修復。本實驗各實驗組的P1潛伏期均無明顯的恢復，提示OECs與α晶體蛋白不能促進視神經纖維髓鞘化，與Li等[2]的研究結果相似，視神經橫斷局部移植的OECs能伴隨視神經纖維生長，但未形成髓鞘。

本實驗通過大鼠視神經損傷后FVEP檢測，證明OECs移植與α晶體蛋白均明顯促進視神經損傷后視功能的恢復，但二者聯合的作用更為明顯。為神經損傷和再生的基礎研究提供理論依據，為神經損傷后再生及功能修復提供新思路。

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(2017-01-20收稿 2017-03-15修回)

(責任編輯 武建虎)

Synergistic effect of olfactory ensheathing cells and alpha-crystallin on visual function recovery of adult rats after optic nerve injury

WANG Yanhua1and WANG Dongwu2.
1.Taiyuan Aier Eye Hospital, Taiyuan 030000, China; 2.Department of Orthopaedics， Hospital 8650, the Chinese People’s Armed Police Force, Jinzhong 030600, China

Objective To investigate the synergistic effect of olfactory ensheating cells (OECs) and α-crystallin on visual function recovery of nerve injury in adult rats.Methods α-crystallin was injected into the vitreous cavity, and OECs were transplanted to the area of optic nerve injury. The function of optic nerves was assessed by flash-elicited visual-evoked potential(FVEP) at 1 and 2 weeks, 1 and 3 months, and immediately after OECs transplantation and α-crystallin injection.Results Compared to PBS, OECs, the combination of OECs and α-crystallin promoted the recovery of the amplitude of P1 wave at 1 week [(8.49±1.19)μv, (9.33±2.54)μv], 2 weeks [(8.85±1.92)μv，(9.43±2.41)μv],1 month [(8.46±1.09)μv，(8.72±1.91)μv], 2 months [(8.12±1.41)μv，(8.48±1.67)μv] and 3 months [(7.68±2.56)μv，(8.08±1.47)μv] after optic nerve injury (P<0.01). The recovery of the amplitude of P1 wave was much more significantin the combination of OECs and α-crystallin group than in other groups. In α-crystallin group, the amplitude of P1 wave partly recovered after 1 and 2 weeks, but decreased after 1 month, and was not significantly different from that of the PBS group after 3 months. The latency of P1 wave did not recover in OECs group, α-crystallin group, or in the combination group.Conclusions Compared to OECs and α-crystallin alone, the effect of the combination of OECs and α-crystallin on functional recovery is significant.

α-crystallin;olfactory ensheathing cells;visual functional recovery

國家自然基金青年基金(31100706)；中國博士后科學基金資助(2012M521872)

王艷華，博士后，副主任醫師。

1.030000，愛爾眼科醫院集團，太原愛爾眼科醫院；

2.030600 晉中，武警8650部隊醫院骨科

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