IFN-γ預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化作用的影響

杜春彥,楊 靜,王曉晨,馮澤國(guó),郭全義,戴 鑫

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IFN-γ預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化作用的影響

杜春彥1,楊 靜1,王曉晨1,馮澤國(guó)1,郭全義2,戴 鑫3

目的 探討干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)預(yù)處理大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)及其抑制脂多糖(lipopolysaccharide ,LPS)誘發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MG)活化作用的影響。方法 采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMMSCs，利用含100 ng/ml 的IFN-γ完全培養(yǎng)液對(duì)BMMSCs進(jìn)行預(yù)處理；利用LPS(10μg/ml)誘導(dǎo)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化。小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化后，以1×105/孔種植于6孔板中，按以下分組將小膠質(zhì)細(xì)胞和BMMSCs以直接接觸的方式進(jìn)行共培養(yǎng)24h：B組(單純BMMSCs組)、L+B組(LPS+ BMMSCs組)、I+B組(IFN-γ預(yù)處理BMMSCs組)、L+I+B組(LPS+IFN-γ預(yù)處理BMMSCs組)、M組(單純MG組)、L+M組(LPS+MG組)、B+L+M組(BMMSCs+LPS+MG組)、I+B+L+M組(IFN-γ預(yù)處理BMMSCs+LPS+MG組)。采用ELISA技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β水平，免疫熒光法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD68表達(dá)。結(jié)果 L+M組小膠質(zhì)細(xì)胞CD68表達(dá)增高，分泌TNF-α、IL-1β含量明顯增多；B+L+M組以及I+B+L+M組的小膠質(zhì)細(xì)胞CD68表達(dá)水平、TNF-α、IL-1β分泌量低于L+M組，且B+L+M組與I+B+L+M組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論 BMMSCs和IFN-γ預(yù)處理的BMMSCs均可以直接接觸的方式抑制LPS誘發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化且經(jīng)IFN-γ預(yù)處理后的BMMSCs對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活性抑制作用更強(qiáng)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；小膠質(zhì)細(xì)胞；活化；預(yù)處理；干擾素γ

神經(jīng)病理性疼痛是由軀體感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病造成的慢性疼痛，近年來(lái)多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞移植可減輕外周或中樞神經(jīng)損傷造成的機(jī)械性和熱性痛覺(jué)過(guò)敏[1-3]。Procko 等[4]發(fā)現(xiàn),干細(xì)胞可被移植微環(huán)境中的炎性因子激活，通過(guò)自身的旁分泌功能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，進(jìn)而發(fā)揮減輕神經(jīng)病理性疼痛的作用[5,6]。王煒煒和李恒等[7]發(fā)現(xiàn)，移植微環(huán)境中的炎性反應(yīng)因子能激活BMMSCs的免疫抑制作用。但是，目前尚無(wú)研究涉及炎性反應(yīng)因子預(yù)處理干細(xì)胞能否增強(qiáng)其抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的功能，本研究擬利用IFN-γ對(duì)BMMSCs進(jìn)行預(yù)處理，探討其對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 4～6周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠6只，體重60～80 g，由解放軍總醫(yī)院動(dòng)物研究中心提供。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 SD大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞(北京裕恒豐科技公司)、SD大鼠基礎(chǔ)培養(yǎng)液α-MEM(Corning)、胎牛血清FBS(Corning)、0.25%胰酶(GIBICO)。小鼠抗大鼠CD68抗體(BD)，fluor 594標(biāo)記羊抗小鼠二抗(Invitrogen)，大鼠TNF-αELISA試劑盒(Raybio)、大鼠IL-1βELISA試劑盒(Raybio)。

1.2.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus，BB5060)，倒置顯微鏡(日本Olympus，IX70)，光學(xué)顯微鏡及照相設(shè)備(日本Nikon，BH-2)，高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman，AllegraX-22R)，酶標(biāo)儀(美國(guó)貝克曼DTX-880)

1.3 方法

1.3.1 BMMSCs分離培養(yǎng)與鑒定 將SD大鼠麻醉處死，無(wú)菌條件下取大鼠股骨、脛骨，用α-MEM反復(fù)沖洗骨髓腔至骨發(fā)白，收集細(xì)胞懸液，1500 r/min離心5 min后棄上清，α-MEM培養(yǎng)液重懸，吹打均勻后以2×105/cm2濃度接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。應(yīng)用差異貼壁方法分離純化細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)傳代培養(yǎng)。取P3代細(xì)胞光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMMSCs表面標(biāo)志物CD29、CD90及造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45。

1.3.2 IFN-γ預(yù)處理 BMMSCs取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代BMMSCs以2×105的密度種植于培養(yǎng)皿中，加入含100 ng/ml IFN-γ培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用0.25%的胰酶消化3 min，收集細(xì)胞以備與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)使用。

1.3.3 BMMSCs與大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng) 將大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞復(fù)蘇后以5×104個(gè)/孔種植于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后使用無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行饑餓處理12 h，后按以下分組將其與BMMSCs以直接接觸的方式、按BMMSCs(1×105個(gè)/孔)：小膠質(zhì)細(xì)胞(5×

104個(gè)/孔)的比例進(jìn)行共培養(yǎng)：B組(單純BMMSCs組)、L+B組(LPS+ BMMSCs組)、I+B組(IFN-γ預(yù)處理BMMSCs組)、L+I+B組(LPS+IFN-γ預(yù)處理BMMSCs組)、M組(單純MG組)、L+M組(LPS+MG組)、B+L+M組(BMMSCs+LPS+MG組)、I+B+L+M組(IFN-γ預(yù)處理BMMSCs+LPS+MG組)。其中LPS的濃度為10 μg/ml。共培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)液上清檢測(cè)TNF-α、IL-1β水平，并用免疫熒光法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況。

1.3.4 ELISA法測(cè)定 TNF-α、IL-1β的含量按照ELISA試劑盒的說(shuō)明步驟操作，檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β的水平

1.3.5 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)各組小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況 留取M組(單純MG組)、L+M組(LPS+MG組)、B+L+M組(BMMSCs+LPS+MG組)、I+B+L+M組(IFN-γ預(yù)處理BMMSCs+LPS+MG組)進(jìn)行CD68的免疫熒光染色。細(xì)胞爬片，用PBS 漂洗5 min，3 次；加入 0.3%過(guò)氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30 min； PBS 漂洗5 min，3 次；封閉液封閉1h，PBS 漂洗5 min，3 次；加一抗小鼠抗大鼠CD68(1∶250)，4 ℃孵育過(guò)夜；PBS 漂洗5 min，3 次；加二抗fluor594標(biāo)記羊抗小鼠熒光二抗(1∶200)，室溫避光孵育1 h； PBS 漂洗5 min，3 次；使用抗熒光衰減封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察拍片，每片各隨機(jī)選取7個(gè)視野觀察并計(jì)算CD68陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞的百分比。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)細(xì)胞接種2 d后，細(xì)胞呈懸浮樣生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)以圓形為主，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈梭形或多角形態(tài)，隨著換液和繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶中貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，懸浮細(xì)胞數(shù)量減少。原代培養(yǎng)的細(xì)胞在接種1周后細(xì)胞集落達(dá)到80%融合。傳代后的BMMSCs分裂、增殖速度明顯變慢，大部分貼壁細(xì)胞保持長(zhǎng)梭形，培養(yǎng)2周后，雜質(zhì)細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞呈放射狀排列，融合片狀生長(zhǎng)，形成典型漩渦狀形態(tài)，細(xì)胞純度較高(圖1)。

圖1 BMMSCs光鏡圖(×100)

A. 原代培養(yǎng)細(xì)胞增殖旺盛，細(xì)胞呈“魚(yú)群樣”；B. P3代BMMSCs細(xì)胞純度較高，細(xì)胞呈“漩渦狀”生長(zhǎng)

2.2 流式細(xì)胞鑒定結(jié)果分析 經(jīng)鑒定，細(xì)胞表面抗原CD29表達(dá)率99.59%，CD90表達(dá)率83.95%，

呈陽(yáng)性；CD34表達(dá)率0.1%，CD45表達(dá)率7%，呈陰性(圖2)。結(jié)果表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合BMMSCs的生物學(xué)特性且純度較高，適合實(shí)驗(yàn)需要。

2.3 Elisa法測(cè)定TNF-α、IL-1β的含量 小膠質(zhì)細(xì)胞被LPS激活后TNF-α和IL-1β含量均明顯上升，與M組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(TNF-α：P=0.000；IL-1β：P=0.000)。與L+M組相比，B+L+M組以及I+B+L+M組的TNF-α和IL-1β表達(dá)水平下降(圖3)，且后2組之間相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(TNF-α：P=0.026；IL-1β：P=0.001)。B組、I+B組、M組、L+B組，L+I+B組TNF-α、IL-1β的水平均較低，且各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 P3代BMMSCs流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果

圖3 BMMSCs抑制小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β

A.M組與L+M組比較,①P<0.001 ； L+M組與 B+ L+M組比較,②P<0.01；L+M組與I+ B+ L+M組比較,①P<0.001； B. L+M組與 I+ B+ L+M組比較,③P<0.05

2.4 免疫熒光法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD68的表達(dá) M組小膠質(zhì)細(xì)胞大部分呈梭形，細(xì)胞表面有許多棘突(圖4)。L+M組小膠質(zhì)細(xì)胞胞體明顯增大，細(xì)胞突起回縮變粗呈 “阿米巴樣”。 單純給予BMMSCs處理后，小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化；予IFN-γ干預(yù)后的BMMSCs處理小膠質(zhì)細(xì)胞后，小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)改善，再次呈現(xiàn)分支樣形態(tài)。M組小膠質(zhì)細(xì)胞表面抗體CD68的陽(yáng)性率為24.7%，L+M組CD68的表達(dá)率為55.2%，兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)；B+ L+M組CD68表達(dá)率為35.2%，低于L+M組(P=0.005)；I+B+L+M組CD68為13.9%，低于L+M組(P=0.000)；I+ B+ L+M組與B+L+M組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。

3 討 論

干細(xì)胞預(yù)處理的應(yīng)用源于不良移植微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞存活和功能發(fā)揮的影響，最早被用于心肌梗死的治療研究。多種預(yù)處理方法可激活干細(xì)胞在不同疾病環(huán)境中的細(xì)胞保護(hù)通路。如缺氧、炎性反應(yīng)因子、基因修飾和藥物預(yù)處理均可提高干細(xì)胞在心肌梗死、原發(fā)性肺纖維化、脊髓缺血再灌注損傷模型中的生存和增殖，并產(chǎn)生梗死面積縮小、左心室射血分?jǐn)?shù)升高、心功能顯著改善、肺修復(fù)能力增強(qiáng)和神經(jīng)功能評(píng)分提高等宏觀保護(hù)作用[8-11]。但是，目前尚無(wú)關(guān)于預(yù)處理干細(xì)胞抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化作用的影響的研究報(bào)道。眾所周知，小膠質(zhì)細(xì)胞的活化在外周及中樞神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮著非常重要作用，而干細(xì)胞則可能通過(guò)促使小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)、降低其對(duì)促炎因子的反應(yīng)[12,13]等機(jī)制抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，因此，如何增強(qiáng)干細(xì)胞對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制作用有重要意義。

炎性反應(yīng)因子與干細(xì)胞的微妙關(guān)系使其成為預(yù)處理的有力候選者。大量研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞只有在足量促炎細(xì)胞因子的刺激下才能發(fā)揮其免疫抑制作用[14-16]。干細(xì)胞產(chǎn)生多種抑制性因子的能力與促炎因子TNF-α、IFN-γ或Toll樣受體配體的水平息息相關(guān)[17]。 IFN-γ是炎性因子中重要的一員，具有廣泛生物學(xué)活性，作為治療藥物被用于抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。微量IFN-γ即可激活間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性，因此本研究采用IFN-γ對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。本研究結(jié)果提示，100 ng/ml的IFN-γ預(yù)處理可增強(qiáng)BMMSCs抑制LPS誘發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。其機(jī)制可能為IFN-γ可與干細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)結(jié)合，通過(guò)JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)干細(xì)胞活化，活化后的干細(xì)胞通過(guò)旁分泌機(jī)制誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型活化，抑制炎性反應(yīng)因子的釋放，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的治療發(fā)揮作用[18，19]。Mohammadpour等[6]發(fā)現(xiàn)，TNF-α與IFN-γ聯(lián)合刺激小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、激活干擾素應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡、減弱小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活對(duì)組織所致的損傷，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)內(nèi)部損傷組織的保護(hù)作用。但該作用是否有劑量依賴性及其潛在作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。同時(shí)，他還發(fā)現(xiàn)BMMSCs可抑制LPS誘發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD68的表達(dá)，減少其促炎因子TNF-α、IL-1β的分泌水平，這與周小琳等[20]研究結(jié)果一致。本研究不足之處：只選用一種細(xì)胞因子IFN-γ對(duì)BMMSCs進(jìn)行預(yù)處理，可能存在預(yù)處理細(xì)胞因子過(guò)于單一的問(wèn)題，但研究結(jié)果提示IFN-γ預(yù)處理BMMSCs后其仍具有抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的功能。因此，下一步研究中，擬采用多種細(xì)胞因子聯(lián)合預(yù)處理并對(duì)給予的細(xì)胞因子濃度進(jìn)行驗(yàn)證，以期找到預(yù)處理更合適的炎性反應(yīng)因子和濃度。

圖4 熒光顯微鏡觀察CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(×400)

綜上所述，采用IFN-γ對(duì)BMMSCs進(jìn)行預(yù)處理，以直接接觸模式將其與LPS活化的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)IFN-γ預(yù)處理的BMMSCs可更顯著抑制LPS誘發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，這為干細(xì)胞更有效的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，但多種炎性反應(yīng)因子聯(lián)合預(yù)處理能否進(jìn)一步增強(qiáng)干細(xì)胞抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用尚需進(jìn)一步的研究。

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(2017-02-22收稿 2017-03-22修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

Inhibitory effects of IFN-γ pretreated bone marrow mesenchymal stem cells on lipopolysaccharide-induced microglia activation

DU Chunyan1, YANG Jing1, WANG Xiaochen1,FENG Zeguo1, GUO Quanyi2,and DAI Xin3.
1.Department of Anesthesiology, 2.Department of Orthopedics, 3.Laboratory Animal Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

Objective To explore the inhibitory effect of pre-treatment of one marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) with interferon-γ and IFN-γ on the activation of microglia(MG) induced by lipopolysaccharide(LPS).Methods BMMSCs were isolated and cultured using the whole bone marrow adherence method. Then, 100ng/ml IFN-γ was used to induce the activation of BMMSCs and10μg/ml lipopolysaccharide was used as the inflammatory stimulating factor to induce the activation of microglia. After isolation and purification, microglia were seeded in 6-well plates at the density of 1×105/well and BMMSCs were co-cultured with microglia with the cell contact cell method for 24 h in the following groups: B group(BMMSCs group), L+B group(LPS+BMMSCs group), I+B group(IFN-γ pretreatment BMMSCs group), L+I+B group(LPS+IFN-γ pretreatment BMMSCs group), M group(microglia group), L+M group(LPS+ microglia group), B+L+M group(BMMSCs+ LPS+ microglia group), and I+B+L+M group(BMMSCs pretreated with IFN-γ+LPS+ microglia group). 24 hours later, the expressions of TNF-α、IL-1βin cell culture supernatants were detected by ELISA kit and the expression of microglia surface marker CD68 was detected by immunofluorescence.Results In the L+M group，LPS promoted the expression of CD68 and the production of TNF-α and IL-1β in microglial cells. The expression of CD68 and the production of TNF-α and IL-1β in B+L+M group and I+B+L+M group were lower than in L+M group, and there was statistically significant difference between the B+L+M group and the I+B+L+M group(P<0.05).Conclusions Both BMMSCs and IFN-γ pretreatment of BMMSCs can inhibit the activation of LPS-induced microglia by direct cell contact. After IFN-γ pretreatment ,BMMSCs could more strongly inhibit the activity of microglia.

bone marrow mesenchymal stem cells; microglia; activation；pretreatment; IFN-γ

杜春彥,碩士研究生，醫(yī)師。

100853 北京，解放軍總醫(yī)院：1.麻醉科，2.骨科,3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

馮澤國(guó),E-mail：beijing_301@sina.com

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