光聲光譜技術鑒別肺炎克雷伯菌的實驗研究

陳文麗，張 曄，宋瑞珍，董友玲，張亞娟，高紅梅

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光聲光譜技術鑒別肺炎克雷伯菌的實驗研究

陳文麗，張 曄，宋瑞珍，董友玲，張亞娟，高紅梅

目的 探索應用光聲光譜技術(photoacoustic spectroscopy，PAS)檢測細菌氣態揮發物(volatile compounds, VCs)，作為一種無創、快速鑒定肺炎克雷伯菌的新方法。方法 利用PAS分別對肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌，以及空白對照組35 ℃培養24 h后產生的VCs進行檢測，獲得各細菌VCs和空白組的光聲光譜圖，并對檢測結果進行分析比較，觀察肺炎克雷伯菌與空白組、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌以及銅綠假單胞菌之間VCs光聲光譜圖的差異。結果 同種細菌之間及空白組之間光聲光譜圖基本重合，表明光聲光譜分析儀性能穩定，實驗重復性好；肺炎克雷伯菌VCs與空白組的光聲光譜圖存在明顯差異，同時肺炎克雷伯菌VCs在1142和1160波數附近出現了波峰，而其他三組檢測細菌(鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌)均未出現。結論 應用PAS通過對肺炎克雷伯菌VCs進行檢測分析，可以將肺炎克雷伯菌與鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌及銅綠假單胞菌進行區分，同時發現肺炎克雷伯菌的特征峰位于1142和1160波數段附近。

揮發性代謝產物；光聲光譜；肺炎克雷伯菌；鑒定

肺炎克雷伯是目前國內院內感染最常見的條件致病菌之一。近年來，由于各種有創技術的大量開展、抗菌藥物的不當使用及激素和免疫抑制藥的廣泛應用，肺炎克雷伯感染的發病率、耐藥率及病死率逐年上升，危害日漸嚴重[1-5]。肺炎克雷伯感染的早期病原學診斷對臨床抗生素的合理選擇具有重要價值。細菌鑒別的方法主要有生化法、培養法、色譜及質譜法等，臨床以培養法最為常用[6-10]。這些方法各有利弊，如生化法操作方便、簡單，但準確性差；培養法最為可靠，但培養需要時間較長[11]。目前，臨床中尚缺乏肺炎克雷伯菌快速、準確的鑒別技術，從而嚴重制約了肺炎克雷伯菌感染性疾病的臨床診斷和治療。

本研究通過應用光聲光譜分析儀對肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌等4種革蘭陰性菌的氣態揮發物的檢測，獲取4種細菌氣態揮發物的光聲光譜圖，并分別將肺炎克雷伯菌與其他3種菌的VCs光聲光譜圖進行對比分析，獲得肺炎克雷伯菌的特征峰，旨在通過特征峰來對肺炎克雷伯菌進行識別。

1 材料與方法

1.1 檢測儀器 光聲光譜分析儀(型號：PASTA-10001)，由中國航天科技集團某研究所協助研制，主要參數：氣體采樣容積為30 ml；檢測時間30 min；檢測精度PPb級；在0～40 ℃的工作條件下，其測量結果不會因環境溫度和氣壓的變化而產生漂移。光聲光譜分析儀的基本檢測原理來自于氣體的比爾朗伯吸收定律，即光聲池中的待測氣體吸收光能量后產生脈沖壓力波，引起周圍聲壓的變化，并被光學微音器檢測到，其聲壓信號的幅度與待測氣體的濃度成正比，可利用比爾朗伯定律計算出該待測氣體的濃度值[6-10](圖1)。

圖1 光聲光譜技術檢測原理

1.2 培養儀器 雙通道玻璃氣密樣品取樣瓶(圖2)為自行設計制作，其特征：(1)密閉，相對不受干擾；(2)雙通道，單向氣流，便于取樣。恒溫恒濕培養箱(型號TH70-HWS-350,北京中西遠大科技有限公司), 控溫范圍:5～50 ℃，溫度波動度：±0.5 ℃；(3)血溶培養皿(型號103，上海微蒙生物科技有限公司)，內徑103 mm,外徑108 mm。

1.3 菌種 肺炎克雷伯菌ATCC46117標準菌株、大腸埃希菌ATCC25922標準菌株、銅綠假單胞菌ATCC27853標準菌株、鮑曼不動桿菌ATCC19606標準菌株，均由武警總醫院檢驗科微生物室提供。

圖2 玻璃氣密樣品取樣瓶

1.4 實驗方法

1.4.1 氣體收集 (1)細菌組：分別挑取單菌落肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌接種在血溶培養皿上，每種細菌各接種2個培養皿并相應地標記為肺克組1和肺克組2、銅綠組1和銅綠組2、大腸組1和大腸組2、鮑曼組1和鮑曼組2； (2)空白組：2個空白血溶培養皿，并相應地標記為空白組1和空白組2；(3)細菌組和空白組均分別置于玻璃氣密樣品取樣培養24 h后對瓶中的頂空氣體進行取樣檢測，并用止血鉗夾閉密閉取樣瓶兩側的橡皮管，放于35 ℃恒溫恒濕培養箱中培養24 h。

1.4.2 氣體檢測 (1)將培養好的取樣瓶自培養箱中取出，將其上端橡膠管直接接入光聲光譜分析儀的進氣口；(2)打開連接進氣口的橡膠管上的止血鉗，對取樣瓶中的氣體真空抽氣并進行檢測，獲得初始實驗數據(檢測波數范圍為1000～1250 1/cm)；重復上述方法檢測其他取樣瓶中的氣體；(3)對各組初始實驗數據用Originpro 8.5繪圖軟件繪出初始光聲光譜圖(X值表示波數 1/cm，Y值表示幅值au)。

1.4.3 光聲光譜圖的分析比較 (1)同一細菌組之間、同一空白組之間的光聲光譜圖進行比較，判斷儀器的穩定性及實驗的重復性；(2)肺克組分別和空白組、鮑曼組、大腸組以及銅綠組的光聲光譜圖進行比較，獲取肺炎克雷伯菌的特征峰，并通過特征峰來對肺炎克雷伯菌進行識別。

2 結 果

2.1 肺克組與空白組光聲光譜比較 圖3顯示，肺克組和空白組的光聲光譜比較結果(部分放大圖)，肺克組1和肺克組2、空白組1和肺克組2的光聲光譜圖形基本吻合，表明實驗中使用的光聲光譜分析儀穩定性較好，實驗重復性好；在1142、1160波數段，肺克組出現波峰，而對照組為較平滑的曲線，考慮上述波數段為肺炎克雷伯桿菌特征性代謝產物出現的波數位置。

圖3 肺克組和空白組35 ℃下培養24 h后光聲光譜結果(部分放大)

2.2 肺克組與鮑曼組光聲光譜比較 圖4顯示，肺克組和鮑曼組的光聲光譜比較結果(部分放大圖)，可以看出，各細菌組1和組2的圖譜基本重合，提示實驗采用的光聲光譜分析儀穩定性好、實驗重復性好。肺克組(包括組1和組2)在1142和1160兩個波數段均出現了波峰，而鮑曼組(包括組1和組2)均為較平滑的曲線，這與圖3中顯示的結果相似。

圖4 肺克組和鮑曼組35 ℃下培養24 h后光聲光譜結果(部分放大)

2.3 肺克組與大腸組光聲光譜比較 圖5顯示，肺克組和大腸組的光聲光譜比較結果(部分放大圖)，可以看出，各細菌組1和組2的圖譜基本重合，提示實驗采用的光聲光譜分析儀穩定性好、實驗重復性好。肺克組(包括組1和組2)在1142和1160兩個波數段均出現了波峰，而大腸組(包括組1和組2)均為較平滑的曲線，這與圖3、4中顯示的結果相似。

圖5 肺克組和大腸組35 ℃下培養24 h后光聲光譜結果(部分放大)

2.4 肺克組與銅綠組光聲光譜比較 圖6顯示，肺克組和銅綠組的光聲光譜比較結果(部分放大圖)，可以看出，各細菌組1和組2的圖譜基本重合，提示實驗采用的光聲光譜分析儀穩定性好、實驗重復性好。肺克組(包括組1和組2)在1142和1160兩個波數段均出現了波峰，而銅綠組(包括組1和組2)均為較平滑的曲線，這與圖3、4、5中顯示的結果相似。

圖6 肺克組和銅綠組35 ℃下培養24 h后光聲光譜結果(部分放大)

3 討 論

傳統培養皿為非密閉的裝置，在細菌培養過程中，細菌代謝產生的微量氣體易彌散于周圍環境中，而這些極低濃度的氣體擴散后會明顯影響檢測結果。基于上述考慮，我們自行設計了氣體采集密閉取樣瓶(簡稱取樣瓶)，其主要特征為：(1)玻璃材質，無色透明，便于觀察細菌生長情況；(2)完全密閉，不受外界空氣的干擾，并能夠濃集細菌培養24 h期間所產生的全部微量氣體，有利于檢出；(3)雙通道，單向氣流，便于取樣。

在微量氣體檢測技術上，筆者選擇的是光聲光譜分析儀，該分析儀將先進的光聲光譜技術與計算機系統相結合，是近年來興起的一種能夠對微量氣體進行快速、可靠地檢測的新技術。其特征：(1)紅外激光光源，波長可調節，測量范圍廣，選擇性高；(2)運用先進的硅微電子機械系統 (micro electrom echanical system，MEMS)懸臂梁光學微音器，靈敏度及精確度進一步提高；(3)體積小，密閉金屬外殼，受外界干擾小；(4)計算機系統化，程序可控，操作簡單；(5)與質譜、色譜及傳感器法相比，檢測周期短，僅為35 min左右，檢測步驟簡潔；(6)樣品前處理便捷，樣品用量少，檢測靈敏度及穩定性較高。

考慮到細菌在生長過程中易受外界環境因素的影響，如溫度、濕度、培養基及培養時間等，有可能導致細菌產生VCs的不同，影響實驗結果。因此，在細菌培養及檢測過程中，各實驗組及對照組均盡量控制在相同條件下進行，減少上述混雜因素的干擾，并選擇了對細菌生長較適宜的溫度(35 ℃)，培養時間也選擇在細菌生長代謝較活躍的時期——對數期(24 h)，以提高實驗的穩定性及精確性。

在本實驗中，筆者檢測了4種革蘭陰性菌的VCs和空白組的VCs，獲得了不同細菌和空白組的VCs光聲光譜圖。結果發現，同種細菌之間、空白組之間的圖形基本吻合，表明實驗中使用的光聲光譜分析儀穩定性好，同種細菌產生的VCs較穩定，且實驗的重復性較好。

肺克組與鮑曼組、大腸組、銅綠組、空白組的比較發現，肺克組在1142和1160波數附近出現波峰，而鮑曼組、大腸組、銅綠組以及空白組均未出現。因此可根據上述特征波峰將肺克組與鮑曼組、大腸組、銅綠組、空白組進行區分。我們認為，1142和1160可能為肺克組VCs所處的特征波數位置。在既往相關研究中，尚未見到有關肺炎克雷伯菌VCs特征波峰的報導。2012年李絢梅等[11]曾利用固相萃取及氣-質聯用技術(SPME-GCMS)研究發現，肺炎克雷伯桿菌的特征性揮發物為丁基羥基甲苯。由于本研究尚未進一步分析1142和1160波數所對應的氣態成份。因此，本研究中發現的1142和1160特征峰所代表的氣態物質究竟與李絢梅等發現的丁基羥基甲苯是否存在怎樣的相關性，目前尚不清楚，有待進一步深入研究來揭示。

目前，檢測VCs的方法主要有氣相色譜法、質譜法、傳感器或電子鼻法和PAS等[1-9]。其中，氣相色譜法與質譜法的檢測模式均是需先明確目標氣體，再檢測目標氣體的存在與否，即“逆推法”；傳感器或電子鼻法則是先通過氣味傳感器進行識別，對整體混合物的生物揮發性特征作出響應，并以某種相似屬性重新組合排列，進而進行區別，即“順比較法”。而光聲光譜法既可以通過“順比較法”，對比不同細菌VCs的光聲光譜圖間的差異來區分目標菌，又可以通過“逆推法”進一步驗證目標氣體的存在。因此，其靈敏度和選擇性也大大提升，這也是該方法的優點所在。

總之，通過光聲光譜技術檢測肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌等4種細菌VCs，并根據其峰位和峰型的不同，可以將肺炎克雷伯菌與其它3種革蘭陰性菌(大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌)進行區分，并發現肺炎克雷伯菌的特征峰位于1142、1160波數附近。光聲光譜技術檢測VCs為細菌的鑒定提供了一種簡單、快速的方法，有望成為臨床早期病原學檢測的新技術。

[1] 王 偉，石 磊，薛 紅，等.綜合醫院肺炎克雷伯菌感染情況及其耐藥性分析[J].醫藥與保健,2014, 22(6): 54-79.

[2] 仇廣翠，孫明忠，邵良榮，等.肺炎克雷伯菌在醫院環境中的分布及耐藥性分析[J].檢驗醫學, 2015, 30(2): 160-162.

[3] 周紅巖，馬國英，韓明芬，等.肺炎克雷伯菌感染的臨床分布與耐藥性分析[J].濱州醫學院學報, 2014, 37(12): 429-431.

[4] 計鶴斌，朱 堅. 266株肺炎克雷伯菌感染臨床分布及耐藥性分析[J].浙江中西醫結合雜志, 2014, 24(11): 1035-1036.

[5] 劉 媛，王本祥，于秀娟. 130株肺炎克雷伯菌感染的臨床分布及耐藥分析[J].醫學信息, 2014, 27(3):297.

[6] Maswadi S M,Glickmana R D,Barsaloub N,etal.Investigation of photoacoustic spectroscopy for biomolecular detection[J].Biomedical Optics,2006,16(1):506.

[7] Priya M,Rao SBS, Ray S,etal. Photoacoustic spectroscopy in the monitoring of breast tumor development: A pre-clinical study[J].Spie Bios,2015,8943(1):131-135.

[8] Belkum A V, Durand G, Peyret M,etal. Rapid clinical bacteriology and its future impact[J].Ann Lab Med, 2013, 33(1): 14-27.

[9] Kunze N, G?pel J, Kuhns M,etal.Detection and validation of volatile metabolic patterns over different strains of two human pathogenic bacteria during their growth in a complex medium using multi-capillary column-ion mobility spectrometry (MCC-IMS)[J]. Appl Micro Biotech, 2013, 97(8): 3665-3676.

[10] Sasidhar M, Lars M B, Andreas S,etal. Detection of volatile metabolites of Escherichia Coli by multi capillary column coupled ion mobility spectrometry[J]. Anal Bioanal Chem, 2009, 394(3): 791-800.

[11] 李絢梅. 部分細菌和真菌特征揮發性有機物的研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2012.

(2017-03-11收稿 2017-04-12修回)

(責任編輯 岳建華)

Application of photoacoustic spectroscopy to initial identification of Klebsiella pneumoniae

CHEN Wenli, ZHANG Ye, SONG Ruizhen, DONG Youling, ZHANG Yajuan, and GAO Hongmei.
Department of Respiration, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100039，China

Objective To develop a noninvasive, quick and reliable method for the identification of Klebsiella pneumonia by detecting its volatile compounds (VCs) using photoacoustic spectroscopy (PAS).Methods Photoacoustic spectroscopy trace analyzer (PASTA) was used to conduct the analysis of bacterial volatile compounds (VCs), such as the volatile metabolites of Klebsiella pneumonia, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. The bacteria were cultured at 35 ℃ and measurement of VCs was performed after 24 hours. After that, the difference in the PAS of VCs between Klebsiella pneumonia, blank, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa was observed.Results The PAS of VCs was basically similar between the same type of bacteria or between the blank groups, indicating that the adopted PASTA was of good performance and the experiment could be easily repeated. Obvious difference in the PAS of VCs was observed between Klebsiella pneumonia and the blank groups, suggesting that new VCs were generated by Klebsiella pneumonia. Besides, the PAS of VCs showed obvious peaks of Klebsiella pneumonia at wave 1142 and 1160 while the PAS of VCs of the other three types of bacteria was smooth at these two wave numbers.Conclusions Identification of Klebsiella pneumonia could be conducted by PAS. The characteristic peak may be located at wave 1142 and 1160.

volatile compounds；photoacoustic spectroscopy；klebsiella pneumonia； identification

陳文麗，本科學歷，主治醫師。

100039 北京，武警總醫院呼吸科

高紅梅，E-mail:gaohm777@sina.com

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