乳腺癌新輔助化療前后p62和XIAP表達的變化及其意義

韓 穎，吳正升，吳 強

乳腺癌新輔助化療前后p62和XIAP表達的變化及其意義

韓 穎，吳正升，吳 強

目的 探討乳腺癌新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy, NCT)前后自噬的變化及其與XIAP變化的關系。方法 應用免疫組化EnVision兩步法檢測NCT前后94對乳腺癌組織中p62和XIAP的表達，觀察NCT后p62和XIAP表達的變化情況，分析其相關性。結果 NCT前乳腺癌標本中，p62高表達率為51.1%(48/94)，XIAP高表達率為84.0%(79/94)；NCT后乳腺癌標本中，p62高表達率升高為81.9%(77/94)，XIAP高表達率降低為35.1%(33/94)。即NCT后p62高表達率明顯升高，XIAP高表達率明顯降低(P均<0.05)。NCT前后相比，p62表達升高的樣本率為73.4%，XIAP表達下降的樣本率為75.5%，且p62表達變化與XIAP表達變化呈顯著負相關(P<0.01)。結論 乳腺癌NCT后自噬增強與XIAP下調共存，且XIAP可能參與NCT后自噬增強的負性調節。

乳腺腫瘤；新輔助化療；自噬；凋亡；p62；XIAP

乳腺癌是我國女性最常見的惡性腫瘤，且發病率逐年上升，已嚴重威脅我國婦女身心健康。新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy, NCT)是目前治療局部晚期乳腺癌的標準方案之一，能使局部晚期乳腺癌降期，提高手術切除率和保乳率，并且利于了解腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[1]。研究表明抗癌療法(如化療、放療、內分泌治療)可誘導腫瘤細胞自噬，并且其是腫瘤細胞產生抗藥性的機制之一[2-3]。自噬是依賴溶酶體途徑對細胞內受損的細胞器和大分子物質進行降解的過程，p62是自噬的標志性蛋白，其表達量可用于監測自噬。XIAP是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族中最受關注的成員，在腫瘤的進展、復發、預后以及腫瘤的化療耐藥中發揮重要作用[4-5]。目前，關于乳腺癌NCT后p62和XIAP表達的變化及其是否存在一定相關性尚未見報道。本文采用免疫組化EnVision兩步法檢測NCT前后p62和XIAP表達的變化，分析其相關性，探討其可能的分子機制及生物學意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2010～2014年安徽醫科大學第一附屬醫院病理科存檔的94對乳腺癌石蠟標本，所有患者術前均經空心針穿刺證實為乳腺浸潤性癌，并進行2～6個周期的NCT后行乳腺改良根治。依據WHO(2012)乳腺腫瘤標準對所有病例進行病理學分型、分級和分期。

1.2 試劑 兔抗人多克隆抗體p62和單克隆抗體XIAP購自Cell Signaling公司，稀釋度分別為1 ∶500和1 ∶100，通用型EnVision兩步法免疫組化試劑盒和DAB顯色劑均購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法 組織均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，HE染色和免疫組化EnVision兩步法染色。65 ℃烤片2 h，脫蠟、水化，高壓修復100 s，自然冷卻后滴加3%H2O2室溫10 min，滴加一抗4 ℃過夜，復溫加二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封固，觀察。以PBS替代一抗作為陰性對照。

1.4 結果判斷 參考近期國外文獻方法，每張切片隨機選取5個高倍視野，每個視野計數200個腫瘤細胞，染色結果判定標準綜合染色強度及陽性細胞率進行。(1)染色強度：無著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分；(2)陽性細胞率：≤10%為0分,11%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。兩者相加判斷表達強度：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性()，6～7分為強陽性()。其中陰性和弱陽性為低表達，中度陽性和強陽性為高表達。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。樣本率之間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關檢驗。

2 結果

2.1 NCT后乳腺癌組織形態學改變觀察 NCT后較NCT前乳腺癌組織發生不同程度的退行性變化：(1)腫瘤實質主要表現為浸潤性癌成分變性、壞死，導致僅殘留原位癌結構或者纖維間質內僅見少數癌細胞呈條索狀、巢團狀排列，甚至僅殘存單個癌細胞；乳腺癌細胞發生類似凋亡的形態學變化，主要表現為細胞皺縮，胞質嗜酸性增強，胞核固縮、染色增強，有時可見奇異型巨核。(2)腫瘤間質變化表現為間質纖維化、水腫、鈣化、含鐵血黃素沉著等。

2.2 NCT前后p62和XIAP在乳腺癌組織中的表達及其變化 (1)p62和XIAP在乳腺癌組織中的表達定位于細胞質和(或)細胞核。NCT前p62主要定位于細胞核且染色較弱，NCT后p62定位于細胞質和細胞核且染色較強；NCT前XIAP定位于細胞質和細胞核且染色較強，NCT后XIAP主要定位于細胞核且染色較弱(圖1、2)。(2)94例NCT前乳腺癌穿刺標本中，p62高表達率為51.1%(48/94)，XIAP高表達率為84.0%(79/94)；94例NCT后乳腺癌手術標本中，p62高表達率升高為81.9%(77/94)，XIAP高表達率降低為35.1%(33/94)。即NCT后p62高表達率明顯升高，XIAP高表達率明顯降低，差異有統計學意義(P均=0.000，表1)。

2.3 NCT后p62和XIAP表達變化的相關性 94對NCT前后乳腺癌標本中，p62表達升高的樣本率為73.4%(69/94)；XIAP表達下降的樣本率為75.5%(71/94)。提示NCT后p62表達變化與XIAP表達變化呈顯著負相關(rs=-0.302，P=0.003，表2)。

①A①B②A②B

圖1 乳腺癌組織中p62的表達變化(同一病例)：A.NCT前p62呈低表達；B.NCT后p62呈高表達，EnVision兩步法

圖2 乳腺癌組織中XIAP的表達變化(同一病例)：A.NCT前XIAP呈高表達；B.NCT后XIAP呈低表達，EnVision兩步法

3 討論

自噬是真核細胞中高度保守又廣泛存在的一種“自我消化”過程，當機體處于饑餓、營養不良等生理情況或暴露于低氧、輻射、細胞毒等壓力環境時，自噬被激活，自噬小體形成，并通過與溶酶體融合成自噬溶酶體降解細胞內受損的細胞器和大分子物質，以實現細胞的再循環、再利用，維持內環境穩定[6-7]。自噬作為細胞的一種適應環境的保護機制，不僅參與細胞成分更新、細胞生長與分化等生理過程，更是參與包括腫瘤發生、發展、治療耐藥等多種病理過程。在腫瘤發生階段，自噬抑制腫瘤形成，發揮抑癌作用；而在腫瘤進展和腫瘤治療過程中，自噬激活則促進腫瘤細胞存活，發揮促癌作用[8]。在放、化療等腫瘤治療過程中，自噬被激活，進而通過溶酶體途徑清除細胞毒性物質、受損的細胞器、循環再利用營養物質，阻止腫瘤細胞凋亡，發揮保護腫瘤細胞的作用[9]。

表1 NCT前后p62和XIAP蛋白表達的變化

表2 NCT后p62和XIAP表達變化的相關性

p62是SQSTM1編碼的具有多個功能性結構域的泛素化蛋白，定位于細胞核，在細胞質中合成。p62通過其UBA區募集泛素化蛋白，借助其PB1區形成大的蛋白聚集體，進而造成p62構象改變，LIR區暴露，最后通過暴露的LIR區與定位于自噬小體膜上的LC3Ⅱ蛋白結合，在自噬溶酶體內降解[10]。p62和LC3Ⅱ是自噬的標志性蛋白，通過免疫組化技術檢測經10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織中p62和LC3Ⅱ的表達可以特異地、穩定地檢測細胞內自噬活性[11-12]。p62結構域中還包含有2個NLS(核定位信號)和1個NES(出核信號)結構域[13]，可以通過與多種入核和出核信號分子結合，而在核質間自由穿梭。本組結果顯示NCT前p62主要定位于細胞核，而NTC后定位于細胞核和細胞質，我們推測化療藥物可能通過激活某種出核信號分子與p62蛋白的NES結構域結合，介導p62蛋白穿梭到胞質中發揮自噬相關作用。

XIAP是IAP家族中的一員，可直接抑制凋亡起始因子Caspase 9以及效應分子Caspase 3與Caspase 7的活性，抑制外源性凋亡信號誘導的細胞凋亡，XIAP在大多數腫瘤組織中高表達并與化療耐藥有關。越來越多的證據表明，在細胞毒性藥物介導的細胞凋亡中，自噬增強與XIAP下調共存[14-15]。本組結果與文獻[14-15]報道一致，NCT后p62高表達率明顯升高，XIAP高表達率明顯降低；p62表達升高的樣本率為73.4%，XIAP表達下降的樣本率為75.5%，提示乳腺癌NCT后自噬增強與XIAP下調共存。

本課題組前期實驗表明，XIAP能夠抑制細胞自噬。本實驗發現，XIAP通過結合并泛素化降解p62，抑制本底水平的自噬，促進腫瘤的生成；另一方面，XIAP下調造成p62介導的自噬增強對于腫瘤的轉移至關重要[16]。Wu等[17]發現XIAP和LC3在肝細胞性肝癌組織中的表達呈負相關，并且低表達XIAP與高表達LC3的肝癌患者預后差，猜測肝癌組織中XIAP下調介導的自噬增強可能是預后差的分子機制。

本實驗不僅證明乳腺癌NCT后自噬增強與XIAP下調共存，通過Spearman等級相關檢驗還發現，NCT后p62表達變化與XIAP表達變化呈明顯負相關，并且NCT前后XIAP表達的定位變化與p62表達的定位變化正好相反，表現為NCT前XIAP定位于細胞質及細胞核而NCT后主要定位于細胞核。結合課題組前期關于XIAP泛素化降解p62的分析，推測NCT后XIAP主要定位于細胞核且表達下調，進一步導致細胞質中XIAP對p62蛋白的泛素化降解作用減弱，最終導致胞質中p62蛋白介導的自噬增強，即NCT后p62介導的自噬增強可能由XIAP下調導致，XIAP可能參與NCT后自噬增強的負性調節，為乳腺癌臨床治療提供新靶點和新思路，且本實驗是在NCT患者活體乳腺腫瘤組織中獲得自噬模型，為乳腺癌患者制定個體化治療方案提供重要的臨床信息。然而，乳腺癌NCT后自噬增強的調節機制以及XIAP如何調節細胞自噬還有待進一步分析。

綜上所述，乳腺癌NCT后自噬增強與XIAP下調共存，且XIAP可能參與NCT后自噬增強的負性調節，為進一步分析自噬活性調節機制提供重要的參考價值。

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Changes of p62 and XIAP expression after neoadjuvantchemotherapy in breast cancer and their significance

HAN Ying, WU Zheng-sheng, WU Qiang

(DepartmentofPathology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Purpose To explore the change of autophagy after neoadjuvant chemotherapy (NCT) and its relationship with XIAP expression in breast cancer tissues. Method The expression of p62 and XIAP was detected by immunohistochemistry of EnVision two-step in 94 cases of breast carcinoma before and after NCT. The changes of p62 and XIAP expression after NCT were observed and their correlation was also analyzed. Results High expression rate of p62 and XIAP was 51.1% (48/94) and 84.0% (79/94) respectively in breast cancer tissues before NCT. The high expression rate of p62 was increased to 81.9% (77/94) and that of XIAP was reduced to 35.1% (33/94) in breast cancer tissues after NCT. The high expression rate of p62 was significantly increased while that of XIAP was significantly decreased after NCT (Pboth<0.05). The sample rate of increased expression of p62 and decreased expression of XIAP was 73.4% and 75.5% after NCT respectively. Furthermore, the change of p62 expression was significantly negatively correlated with the change of XIAP (P<0.01). Conclusion Suppression of XIAP and increased autophagic activity coexist in breast cancer after NCT, and XIAP may be involved in the negative regulation of enhanced autophagy.

breast neoplasm； neoadjuvant chemotherapy； autophagy； apoptosis； p62； XIAP

國家自然科學基金(81372476、81472493)

安徽醫科大學病理學教研室，合肥 230032

韓 穎，女，碩士研究生。E-mail: 1039400311@qq.com 吳 強，男，博士生導師，通訊作者。E-mail: aydjohn@yahoo.com

時間：2017-5-17 23:52 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.003.html

R 737.9；R 730.53

A

1001-7399(2017)05-0481-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.003

接受日期：2017-03-10