子宮頸鱗癌中MK、p63α的表達及臨床意義

方慧英，黃永平，李愛霞

子宮頸鱗癌中MK、p63α的表達及臨床意義

方慧英，黃永平，李愛霞

目的 探討MK、p63α在正常子宮頸鱗狀上皮和子宮頸鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)組織中的表達及其意義。方法 采用免疫組化SP法檢測30例正常子宮頸鱗狀上皮和98例子宮頸SCC組織中MK、p63α的表達，并分析兩者表達的相關性及與臨床病理特征、預后的關系。結果 MK在正常子宮頸鱗狀上皮組織中幾乎不表達，在子宮頸SCC組織中的高表達率與低表達率分別為28.6%和38.8%；p63α在正常子宮頸鱗狀上皮組織中高表達率與低表達率分別為73.3%和16.7%，在子宮頸SCC組織中高表達率與低表達率分別為34.7%和45.9%，差異有統計學意義(P<0.01)。p63α和MK在子宮頸SCC組織中的表達呈負相關(rs=-0.372，P<0.01)；p63α和MK表達與患者年齡、腫瘤直徑和組織分化有相關性(P<0.05)，與臨床分期、淋巴結轉移無相關性(P>0.05)。MK高表達患者的生存期顯著低于陰性患者；p63α陰性患者生存率顯著低于高表達患者。結論 MK、p63α表達與子宮頸癌的發生、發展密切相關，聯合檢測兩者有助于子宮頸癌預后的判斷。

子宮頸腫瘤；MK；p63α；免疫組織化學

子宮頸癌是全球常見的女性生殖系統惡性腫瘤之一，近年其發病呈年輕化趨勢。子宮頸癌的發生、發展是多因素、多階段長期作用的過程，鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)是子宮頸癌最主要的病理類型，分析子宮頸SCC發生、發展的分子機制，并對其進行干預，有助于提高患者的生存率和生存質量。中期因子(midkine, MK)是一種肝素結合生長和分化因子，與多種腫瘤的發生、發展有關，可能在腫瘤血管形成中起重要作用，國外有學者主張檢測MK作為惡性腫瘤的篩查和隨訪指標[1-2]。p63也與腫瘤的侵襲、轉移以及預后密切相關[3]。本文采用免疫組化SP法檢測MK、p63α在正常子宮頸鱗狀上皮和子宮頸SCC組織的表達，探討兩者表達的相關性及與子宮頸癌臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取安徽醫科大學附屬省立醫院婦產科2008年1月～2011年3月收治的98例子宮頸SCC患者，年齡30～68歲，中位年齡45歲。依據1994年FIGO分期標準，Ⅰ期59例，Ⅱ期39例，所有患者術前均未接受任何輔助治療且隨訪資料完整。另選取同期30例行全子宮切除的子宮肌瘤或子宮腺肌癥患者的正常子宮頸上皮組織，年齡25～62歲，中位年齡44歲，兩組間患者年齡差異無統計學意義。

1.2 試劑 抗原修復液、PBS緩沖液、DAB(ZLI-9049)顯色劑、蘇木精、中性樹脂、通用性二抗，均購自北京中杉金橋公司。p63α鼠抗人單克隆抗體購自英國Abcam公司，MK鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3 方法 組織蠟塊2 μm厚連續切片，展鋪于玻片上干燥后，置于60 ℃恒溫烤箱烘烤12 h；切片常規脫蠟，置于pH 8.6的枸緣酸鈉溶液中高壓抗原修復，270 ℃煮沸，噴氣后計時2 min后立即關火，室溫下冷卻；自來水沖洗，置于3% H2O2溶液8 min，自來水沖洗，PBS溶液浸泡5 min；滴加一抗，4 ℃過夜，PBS沖洗；滴加生物素標記的二抗，室溫下作用30 min，PBS沖洗；DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固。由三位病理醫師采用盲法對免疫組化結果進行評估。顯微鏡下每張切片隨機選取5個視野，根據每個視野中陽性細胞數占總上皮細胞數的百分比和染色深淺進行評分。陽性細胞數判斷：陽性細胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強度評分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，深黃色或棕黃色為3分。兩項相乘采用半定量積分：0分為陰性，1～4分為低表達，>4分為高表達。

1.4 隨訪 采用電話、門診復查等方式隨訪，次數不限?；颊呱鏁r間以手術日始，截止日期為2016年7月，失訪5例，中位隨訪時間為48個月(6～102個月)，子宮頸癌死亡10例，其中Ⅰ期患者7例，Ⅱ期患者3例。

1.5 統計學處理 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，各蛋白的表達水平與臨床病理特征間關系采用Mann-whitneyU檢驗或Kruskal-wallis秩和檢驗，各蛋白之間的相關性分析采用Spearman等級相關檢驗，各蛋白表達對患者生存率的影響采用Kaplan-Meier法分析，生存率曲線的比較采用Log-rank檢驗方法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MK與p63α蛋白在正常子宮頸鱗狀上皮、SCC組織中的表達 正常子宮頸鱗狀上皮組織中MK幾乎不表達；MK在子宮頸SCC組織中主要表達在細胞質和細胞核，呈黃色或棕黃色，在子宮頸SCC組織中高表達率與低表達率分別為28.6%(28/98)、38.8%(38/98)；結果顯示子宮頸SCC組中MK的表達高于正常子宮頸鱗狀上皮組，差異有統計學意義(P<0.01，表1，圖1)。p63α主要表達在細胞核中，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀染色，在正常子宮頸鱗狀上皮組中高表達率與低表達率分別為73.3%(22/30)、16.7%(5/30)；在子宮頸SCC組中高表達率與低表達率分別為34.7%(34/98)和45.9%(45/98)；結果顯示p63α在子宮頸SCC組中的表達明顯低于正常子宮頸鱗狀上皮組，差異有統計學意義(P<0.01，表1，圖1)。

ABCD

圖1 MK和p63α在正常子宮頸鱗狀上皮及子宮頸SCC組織中的表達，SP法：A.MK高表達；B.p63α低表達；C.MK低表達；D.p63α高表達

2.2 子宮頸SCC組織中MK與p63α表達的相關性 在98例子宮頸SCC組織中，22.5%(22/98)的癌組織呈p63α高表達，MK陰性；23.5%(23/98)呈p63α和MK共同低表達；7.1%(7/98)呈p63α陰性、MK高表達；16.3%(16/98)呈p63α低表達、MK高表達，采用Spearman檢驗p63α和MK的表達相關性，相關系數為-0.372，兩者呈負相關(P<0.01，表2)。

2.3 p63α和MK蛋白表達與子宮頸SCC臨床病理特征相關性 子宮頸癌組織中p63α、MK表達與患者年齡、腫瘤大小、組織分化有相關性，差異有統計學意義(P<0.05)；兩種蛋白表達與臨床分期、淋巴結轉移無相關性，差異無統計學意義(P>0.05，表3)。

2.4 MK和p63α蛋白表達與子宮頸SCC患者預后的相關性分析 對98例子宮頸SCC患者進行隨訪，其中失訪5例，死亡10例，5年生存率89.8%。子宮頸SCC患者中MK高表達患者病死率為28.6%(8/28)，低表達患者病死率為5.3%(2/38)，陰性患者病死率為0(0/32)。p63α高表達患者病死率為5.9%(2/34)，低表達患者病死率4.4%(2/45)，陰性患者病死率31.6%(6/19)。分別對MK和p63α進行Log rank檢驗，提示兩種蛋白的表達水平不同，生存率有統計學意義(χ2=15.85、24.90，P<0.01，圖2)。

圖2 A.MK蛋白不同表達水平的Kaplan-Meier生存曲線；

分組nMK陰性低表達高表達χ2值P值p63α陰性低表達高表達χ2值P值正常子宮頸鱗狀上皮30254122．370．000?352211．160．001?子宮頸SCC98323828194534

*P<0.05

表2 子宮頸SCC組織中MK和p63α蛋白表達的相關性

*P<0.05

3 討論

MK是一種分泌型的堿性肝素結合蛋白，成熟的人MK蛋白相對分子質量1.3×104，富含堿性氨基酸殘基和半胱氨酸殘基，MK能促進細胞有絲分裂和增殖、血管生成、增強纖溶酶原激活劑活性、誘導細胞惡性轉化，參與炎癥修復和腫瘤浸潤，從而影響腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡和遷移[4-6]，其中，MK通過激活ER或PI3激酶途徑抑制Caspase 3激活，從而抑制細胞凋亡，MK還通過調節Akt、ERK1/2途徑促進腫瘤的生長。MK具有抗藥蛋白的作用，高表達MK的腫瘤細胞系對化療藥物的抵抗性明顯增強，并且這種抗性具有鄰近效應，耐藥細胞通過分泌MK分子作用于其周圍的藥物敏感細胞，使腫瘤整體具有抗藥性[7-8]，MK在正常組織中不表達或低表達，在很多惡性腫瘤中表達增強，包括Wilms瘤、胃癌、結直腸癌、神經母細胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、肺癌等，高表達MK患者的預后相對于低表達患者差[9]，本實驗中MK高表達的子宮頸SCC患者生存期顯著低于陰性者。

p63屬于p53家族成員，在各種上皮組織的發育、分化和形態中發揮重要作用。p63根據N端的剪切方式不同分為TAp63和ΔNp63；根據C端的剪切方式不同，分為p63α、β、γ、δ、ε[3]，而在子宮頸癌等鱗狀上皮腫瘤中，以ΔNp63α亞型表達為主，其很可能是子宮頸SCC分化的敏感指標之一，p63在子宮頸高分化SCC中高表達，而在中、低分化子宮頸SCC中表達顯著降低[10]。p63表達水平高的腫瘤患者預后相對較好[11]。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮細胞獲得有效遷移能力的主要方式，ΔNp63α的喪失會導致EMT的發生，增加上皮細胞惡性生物學行為。p63α在發生EMT的子宮頸癌組織中低表達，在未發生EMT的組織中表達水平相對較高，低表達ΔNp63α的患者發生腫瘤轉移和復發的危險性更高、預后也更差，過表達ΔNp63α能抑制細胞的轉移和侵襲能力[12]。本實驗中p63α高表達的子宮頸SCC患者生存期顯著高于陰性者，提示p63α可作為判斷預后的指標。

本實驗結果表明，在子宮頸SCC中MK與p63α的表達呈負相關(rs=-0.372，P<0.01)，在子宮頸SCC組織中MK的表達高于正常子宮頸鱗狀上皮組，p63α在子宮頸SCC組織中的表達明顯低于正常子宮頸組織(P<0.01)。Moon等[13]發現子宮頸癌組織中MK的mRNA和蛋白的表達均高于正常對照組，且其程度與腫瘤大小、臨床分期有關，也有學者指出MK在子宮頸癌中高表達且與腫瘤分級相關[14]。在本實驗中，兩種蛋白的表達與組織分級、腫瘤大小和年齡顯著相關(P<0.05)，與臨床分期及淋巴結轉移無相關性，推測也可能是樣本量不足導致本組統計分析MK表達與子宮頸癌臨床分期無相關性。

鑒于MK與p63α均參與調控子宮頸癌的發展和預后，本組利用免疫組化SP法檢測兩者在子宮頸SCC中的表達，對其臨床病理特征和預后進行分析，并進一步探討兩者表達的相關性。結果顯示兩者呈負相關，推測MK與p63α可能協同調節子宮頸癌的發展。因此，進一步分析兩者的調控關系有助于闡明子宮頸癌的發展機制，為改善子宮頸癌的預后提供重要線索。

表3 MK、p63α與子宮頸SCC臨床病理特征的比較分析

*P<0.05

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安徽省高等學校自然科學研究項目資助(KJ2015A375、KJ2016A249)、安徽省高校省級質量工程項目(2016 jxtd044)

安徽人口職業學院護理系婦產科教研室，池州 247099

方慧英，女，碩士，副教授。E-mail：1749324992@qq.com

時間：2017-5-17 23:54 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.026.html

R 737.33

B

1001-7399(2017)05-0573-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.026

接受日期：2017-03-15