睪丸原發性彌漫大B細胞淋巴瘤中EZH2蛋白的表達及其意義

馬世榮，王映梅，劉 楊，郭雙平

睪丸原發性彌漫大B細胞淋巴瘤中EZH2蛋白的表達及其意義

馬世榮1,2，王映梅1,2，劉 楊2，郭雙平1,2

目的 探討睪丸原發性彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)中EZH2蛋白的表達、臨床病理特征及意義。方法 采用免疫組化Ventana Ultra View兩步法檢測17例睪丸原發性DLBCL中EZH2蛋白的表達，并結合文獻分析其病理形態、診斷及鑒別診斷。采用Sanger法檢測EZH2 641位點酪氨酸(Y641)突變。結果 11例腫瘤細胞類似中心母細胞，3例腫瘤細胞類似免疫母細胞，3例腫瘤細胞具有間變亞型特點。免疫組化標記顯示14例為非生發中心B細胞樣(non germinal centre B cell like, non-GCB)型，3例為生發中心B細胞樣(germinal centre B cell like, GCB)型；其中15例腫瘤細胞核強陽性表達EZH2蛋白，2例約70%腫瘤細胞核中等強度表達EZH2蛋白；未檢測到EZH2 Y641點突變。隨訪9例患者，中位生存時間35個月，EZH2蛋白的表達與患者預后無相關性。結論 睪丸原發性DLBCL屬于少見的非霍奇金淋巴瘤，具有獨特的臨床病理學特征，絕大部分為non-GCB型；EZH2蛋白在睪丸原發性DLBCL過表達，其有望成為腫瘤診斷及治療的新靶點。

睪丸原發性彌漫大B細胞淋巴瘤；EZH2；臨床病理學特征；免疫表型；預后

原發性睪丸淋巴瘤(primary testicular lymphoma, PTL)屬于少見的高度侵襲性結外非霍奇金淋巴瘤，占非霍奇金淋巴瘤的1%～2%，好發于60歲以上的老年男性[1-2]，其中原發性睪丸彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)占80%～90%。該病例少見，診斷較為困難。近年有研究發現組蛋白甲基轉移酶——EZH2蛋白在多種惡性腫瘤包括淋巴瘤中異常表達，有望成為腫瘤診斷及治療的新靶點[3-4]。本文回顧性分析17例原發于睪丸的DLBCL相關資料，探討其臨床病理學特征及EZH2蛋白表達的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2002年1月～2014年3月第四軍醫大學西京醫院住院治療并有完整臨床資料的17例原發于睪丸的DLBCL患者(表1)；所有病例均在第四軍醫大學西京醫院病理科經病理組織學和免疫組化染色明確診斷。

1.2 方法 手術標本均經10%中性福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋、連續切片，行常規HE及免疫組化Ventana Ultra View兩步法染色。所用抗體包括EZH2(USA)、CD20、CD3、CD21、CD10、BCL-6、MUM1、Ki-67(DAKO公司)，采用 Roche Benchmark XT全自動免疫組化染色儀進行染色。

1.3 結果判讀 CD3、CD20、CD21、CD10以胞膜彌漫棕黃色顆粒為陽性；BCL-6、MUM1、Ki-67、EZH2以胞核內呈棕黃色顆粒為陽性；同時設立空白對照。其中CD10、BCL-6、MUM1的判讀，需至少大于30%的腫瘤細胞表達抗體判斷為陽性。

1.4 DNA提取、PCR及測序 制備5～10 μm厚的組織塊，使用QIAGEN DNA FFPE試劑盒提取基因組DNA。應用正向引物：5′-GGCTGGGGGATTTTTATCAA-3′和反向引物：5′-GTTATCAGTGCCTTACCTCTCCA-3′，對包含EZH2 Y641位點編碼基因的DNA進行PCR擴增。使用相同的引物序列對正向和反向的PCR產物進行測序。

2 結果

2.1 臨床特點 本組17例原發睪丸DLBCL患者發病年齡26～86歲，平均58.8歲，>60歲者10例(占58.8%)。5 例(29.4%)為左側睪丸受累，9例(52.9%)為右側睪丸受累，3例(17.6%)為雙側睪丸受累(表1)。17例患者均未見睪丸外侵犯，首發癥狀均為患側睪丸無痛性腫大。

2.2 病理檢查 眼觀：多數腫物界限清楚，少數腫物與周圍組織界限不清。腫物直徑1.5～8 cm，平均5.6 cm，切面灰白、灰黃色，實性、質硬。鏡檢：低倍鏡下，正常睪丸結構被破壞，腫瘤性淋巴細胞彌漫浸潤，其中1例發生大片壞死(圖1)。高倍鏡下，腫瘤細胞體積較大、中等量胞質，細胞核呈圓形，細胞之間缺乏黏附性。17例中有11例腫瘤細胞核內可見2～3個小核仁，類似于中心母細胞(圖2)，有3例腫瘤細胞核內可見1個居于中央的大核仁，類似于免疫母細胞。有3例形態學上具有間變特點，細胞體積大，細胞核異型性及多形性更加明顯，可見多核或巨核瘤細胞，病理性核分裂象多見(圖3)。1例可見睪丸白膜侵犯，1例可見血管受累。

2.3 免疫表型分型 17例睪丸原發性DLBCL的腫瘤細胞均彌漫強陽性表達B細胞標志物CD20(圖4)，根據Hans法對腫瘤進行分型，即根據腫瘤細胞表達CD10、BCL-6及MUM1的情況進行分型，分為生發中心B細胞樣(germinal centre B cell like, GCB)型和非生發中心B細胞樣(non-germinal centre B cell like, non-GCB)型。如果腫瘤細胞CD10呈陽性，或僅有BCL-6呈陽性，MUM1呈陰性，則為GCB型；如果腫瘤細胞MUM1呈陽性，CD10呈陰性、BCL-6呈陽性或陰性，則為non-GCB型。根據Hans法對本組17例進行分型，其中non-GCB型14例，GCB 型3例(表1)。腫瘤細胞Ki-67增殖指數為34%～95%(圖5)。

表1 17例睪丸原發性DLBCL的臨床病理特征

2.4 EZH2蛋白的表達及突變檢測 本組均表達EZH2蛋白(圖6)，其中15例腫瘤細胞核強陽性表達EZH2蛋白，2例約70%腫瘤細胞中等強度表達

①②③④⑤⑥

圖1 腫瘤組織周邊可見大片壞死 圖2 腫瘤細胞體積較大，核圓形，細胞之間彼此缺乏黏附性，細胞核內可見2～3個小核仁，類似于中心母細胞 圖3 腫瘤細胞體積大，細胞核異型性及多形性更加明顯，可見多核或巨核瘤細胞，病理性核分裂象易見 圖4 腫瘤細胞胞膜彌漫表達CD20，Ventana Ultra View兩步法 圖5 腫瘤細胞Ki-67增殖指數為34%～95%，Ventana Ultra View兩步法 圖6 腫瘤細胞胞核彌漫強表達EZH2，Ventana Ultra View兩步法

EZH2蛋白。腫瘤周圍殘存曲細精管及正常淋巴細胞不表達EZH2蛋白。本組均行EZH2的Y641突變檢測，未發現突變。

2.5 治療及預后 17例患者均進行患側睪丸切除，部分患者術后按CHOP或R-CHOP方案進行化療。9例患者獲得隨訪資料，隨訪時間5～48個月，其中3例患者存活，6例患者死亡，中位存活時間為35個月(表1)。

3 討論

DLBCL是一組異質性腫瘤，淋巴結外DLBCL的發病機制、免疫表型、分子遺傳學特點、治療及預后可能與發生于淋巴結者不同，如中樞神經系統、皮膚、縱隔原發性DLBCL在WHO(2008)淋巴造血系統腫瘤分類中將其作為特殊類型[5]，同時睪丸原發性DLBCL預后差、具有特殊性，目前關于其臨床病理學研究較少，特別是缺乏靶向治療的靶點。因此，針對這一現象，本組檢測17例睪丸原發DLBCL中EZH2蛋白的表達情況，首次發現EZH2蛋白在睪丸原發DLBCL中過表達，并探討其與腫瘤臨床病理特征的關系。

3.1 臨床病理特點 PTL于1877年由Malassez[6]首次報道，占全部睪丸腫瘤的9%，非霍奇金淋巴瘤的1%～2%，發病率約為0.26/10萬[7]。多發于老年患者，是60歲以上老人睪丸惡性腫瘤中最常見類型[8]，其中80%～90%的PTL為DLBCL，本組睪丸原發性DLBCL患者年齡26～86歲， 60歲以上患者占58.8%，與文獻報道的好發年齡一致[9]。5例發生在左側睪丸，9例發生在右側睪丸，3例雙側睪丸受累，首發癥狀均為患側睪丸無痛性腫大。

3.2 組織學特征 多數腫瘤與周圍組織界限清楚，個別病例腫瘤浸潤周圍組織。腫瘤直徑1.5～8 cm，切面呈灰白、灰黃色，實性、質地中等。形態學上，腫瘤細胞體積較大，核圓形，細胞之間彼此缺乏黏附性，彌漫性浸潤睪丸組織。其中14例為中心母細胞型，3例為免疫母細胞型，3例具有散在分布的異型性和多形性顯著的腫瘤細胞，細胞體積大，中等量胞質，核染色質粗、細胞核形態不規則、巨核或多核、核膜增厚、核仁明顯、核染色質呈空泡狀或粗顆粒狀，具有間變形態為間變亞型。1例可見大片壞死。

3.3 EZH2蛋白表達與基因突變 本組腫瘤細胞均彌漫強陽性表達B細胞標志物CD20，根據Hans法對腫瘤進行分型，其中non-GCB型14例(82.3%)，GCB 型3例(17.7%)，與文獻報道的睪丸原發DLBCL的Hans分型以non-GCB型為主相符合[10]。Ki-67增殖指數為34%～95%，Ki-67增殖指數與分型無關。

近年研究發現組蛋白甲基轉移酶——EZH2蛋白的異常表達和Y641熱點突變與多種惡性腫瘤包括淋巴瘤的發生、發展有著密切的關系[11-12]。有文獻報道EZH2蛋白參與前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤、惡性膠質瘤、原發髓母細胞瘤、骨髓惡性腫瘤等腫瘤的發生、發展[13]。其中在淋巴造血系統腫瘤，如DLBCL、濾泡性淋巴瘤、骨髓增生異常、骨髓增生性疾病等腫瘤中均有EZH2的突變或缺失。目前，EZH2的Y641突變已經成為淋巴瘤分析的生物學熱點，突變可以增加編碼蛋白的活性，導致H3K27me3水平增高，從而促進淋巴瘤細胞的增殖[14-15]。此外，EZH2蛋白還與腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性有關[16]，可能是新的腫瘤治療靶點。

本實驗采用免疫組化Ventana Ultra View兩步法對EZH2蛋白進行染色，其中15例腫瘤細胞中EZH2蛋白呈強陽性，2例約70%腫瘤細胞EZH2蛋白呈中等陽性，而非腫瘤性淋巴細胞及殘存曲細精管不表達EZH2蛋白。本組結果表明：與非腫瘤性反應性淋巴結比較，17例睪丸原發性DLBCL均有EZH2蛋白的過表達，且腫瘤組織表達EZH2蛋白水平與腫瘤細胞形態學、免疫表型無相關性。同時，17例組織標本均進行EZH2 Y641點突變檢測，結果均未發現突變。據文獻報道，在高度侵襲性的淋巴瘤如NK/T細胞淋巴瘤中，雖然有EZH2蛋白的過表達，但未改變細胞內H3K3甲基化水平，因此并未出現EZH2基因突變[17]。由此可以推斷EZH2蛋白的過表達與是否具有EZH2基因突變無必然的聯系。EZH2在腫瘤組織異常表達可能不依賴于是否有EZH2基因的突變。EZH2抑制劑有望成為DLBCL有效的靶向治療藥物[18-20]，且EZH2抑制劑可同時抑制EZH2突變型和野生型的DLBCL腫瘤細胞生長[19]。 因此，檢測腫瘤組織中EZH2蛋白的表達水平可為EZH2的靶向治療提供依據。

3.4 鑒別診斷 睪丸原發性DLBCL屬于罕見睪丸腫瘤，其組織學表現與睪丸其他腫瘤有相似之處，且其臨床表現也缺乏特異性，易與其他腫瘤混淆。因此要想明確診斷，必須將臨床表現、組織學特點及免疫表型相結合。原發于睪丸的DLBCL需與以下疾病進行鑒別：(1)睪丸精原細胞瘤，發病年齡低，平均40歲，鏡下腫瘤細胞大而一致，胞質透明，核仁明顯，腫瘤周圍可見淋巴細胞浸潤，曲細精管結構常被破壞。免疫組化染色顯示腫瘤細胞表達SALL4、CD117及PLAP，有助于鑒別診斷。(2)慢性睪丸炎，一般由化膿性炎轉變而來，鏡下細胞成分較為混雜，主要為淋巴細胞、漿細胞及中性粒細胞等多種炎細胞彌漫浸潤，鑒別較為容易。(3)胚胎性癌，年輕患者多見，典型病變組織學可以出現乳頭狀或腺管樣結構，較易診斷。當腫瘤彌漫生長，呈實體型時則需與淋巴瘤進行鑒別。免疫組化染色腫瘤細胞表達CK、SALL4及PLAP，有助于鑒別診斷。

3.5 治療及預后 睪丸原發性DLBCL屬于高度侵襲性的腫瘤，患者的治療主要是行睪丸根治性切除，術后輔以化療，化療方案主要為CHOP或R-CHOP。本組患者均進行患側睪丸根治性切除，9例患者獲得隨訪資料，隨訪時間5～48個月。其中，7例術后進行CHOP或R-CHOP方案的化療，2例未進行化療。9例中6例患者死亡，3例患者存活。

總之，睪丸原發性DLBCL是一種少見的特殊類型淋巴瘤，具有高度侵襲性，診斷及鑒別診斷均具有一定困難。EZH2蛋白在睪丸原發性DLBCL中的表達，有望成為分子靶向治療的依據。

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Expression and significance of EZH2 protein in primarytesticular diffuse large B cell lymphoma

MA Shi-rong1,2, WANG Ying-mei1,2, LIU Yang2, GUO Shuang-ping1,2

(1DepartmentofPathology,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;2DepartmentofPathology,XijingHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

Purpose To explore the expression and significance of histone methyltransferase EZH2, clinicopathological features in primary testicular diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). Methods Immunohistochemical of Ventana Ultra View two-step staining was used to detect expression of EZH2 in 17 cases of primary testicular DLBCL. The relationship between EZH2 expression and its clinicopathological features were analyzed. Sanger squencing was used to detect EZH2 Y641 mutation in these cases. Results Morphologically, the tumor cells resembled centroblasts in 11 cases, immunoblasts in 3 cases, and anaplastic variants in 3 cases. Immunophenotypically, 14 cases were non-germinal centre B cell like (non-GCB) type and 3 cases were germinal centre B cell like (GCB) subtype. EZH2 overexpressed in all 17 cases. EZH2 overexpressed in nearly tumor cells with uniformly strong intensity in 15 cases, and more than 70% tumor cells with moderate to strong intensity in 2 cases. The follow-up information was obtained in 9 patients, with a median survival time of 35 months. No association was found between the level of EZH2 expression and outcome of patients. No mutation of EZH2 Y641 was detected. Conclusion Primary testicular DLBCL is a rare aggressive B cell lymphoma with distinctive clinicopathological features. Detection of EZH2 expected to assist in the diagnosis and treatment of tumor.

primary testicular diffuse large B cell lymphoma；EZH2； clinicopathological feature； immunophenotype； prognosis

國家自然科學基金(81472597)

1第四軍醫大學病理學教研室，西安 7100322第四軍醫大學西京醫院病理科，西安 710032

馬世榮，女，講師。Tel:(029)84773412，E-mail： mashirong_@163.com 郭雙平，女，碩士生導師，副教授，通訊作者。Tel:(029)84773412，E-mail： guoshuangping@163.com

時間：2017-5-17 23:52 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.004.html

R 737.21

A

1001-7399(2017)05-0485-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.004

接受日期：2017-03-17