骨肉瘤中Axl抑制凋亡及與凋亡蛋白的相關性

蔣 念，王雪迪，田 銳，謝顯彪，賴英榮，彭挺生

骨肉瘤中Axl抑制凋亡及與凋亡蛋白的相關性

蔣 念1，王雪迪1，田 銳1，謝顯彪2，賴英榮1，彭挺生1

目的 探討受體酪氨酸激酶Axl在骨肉瘤中的抗凋亡作用，分析磷酸化Axl(P-Axl)與抗凋亡蛋白之間的相關性。方法 常規培養骨肉瘤細胞株MG63、143B和U2OS，分別設立人重組蛋白Gas6刺激組、Axl siRNA轉染組、Gas6刺激+Axl siRNA轉染組及各陰性對照組，應用順鉑(DDP)或氨甲喋呤(MTX)致使細胞凋亡后，通過Hoechst 33258染色、MTT實驗、Annexin V-FIFC等檢測法統計分析不同處理組間細胞凋亡率的差異及不同濃度Gas6刺激后骨肉瘤細胞的細胞周期變化；采用免疫組化EnVision兩步法檢測41例骨肉瘤及18例骨纖維結構不良組織中P-Axl、BCL-2及Bax的表達，分析患者預后與三者的相關性；應用TUNEL染色分析骨肉瘤組織中P-Axl表達水平與細胞凋亡率的相關性。結果 Hoechst 33258、MTT、Annexin V-FIFC等的實驗結果一致，均表明骨肉瘤細胞株MG63、143B和U2OS中Gas6通過活化Axl降低DDP或MTX導致的細胞凋亡率(P<0.05)，Axl siRNA則引起細胞凋亡率增加(P<0.05)，在Axl siRNA干擾前Gas6預刺激有降低凋亡率的趨勢。41例骨肉瘤組織中P-Axl、BCL-2、Bax的陽性率分別為85.4%、70.7%及36.6%；18例骨纖維結構不良組織中三者陽性率分別為11.1%、22.2%及11.1%，兩組相比骨肉瘤組織中P-Axl、BCL-2、Bax的表達明顯增高(P<0.05)。Pearson相關性分析顯示BCL-2表達與P-Axl呈顯著正相關(r=0.842，P<0.000 1)；Cox單因素風險回歸分析發現BCL-2和Bax表達是影響患者預后的預測因素；TUNEL結果顯示P-Axl高表達的骨肉瘤組織中細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。結論 骨肉瘤中Gas6/Axl活化后通過調節凋亡蛋白BCL-2，抑制由DDP或MTX誘發的細胞凋亡，從而促進腫瘤的進展。

骨肉瘤；Axl；BCL-2；細胞凋亡；預后

骨肉瘤是原發于骨的惡性腫瘤，好發于兒童和青少年，其惡性度高，易發生早期肺轉移。目前采用新輔助化療和外科手術相結合的標準治療方式，但由于缺乏早期診斷指標和腫瘤化療耐受等因素，患者的預后情況較差[1]。Axl是TAM酪氨酸激酶受體家族中的一員，其家族成員中還包括Tyro3等[2-3]。TAM酪氨酸激酶受體家族有2個共同的配體Gas6和protein S，其中Gas6/Axl蛋白復合物參與調控體內腫瘤多種生物學行為，如細胞增殖、凋亡、遷移、黏附等[4]。細胞凋亡即細胞程序性死亡，與體內多種疾病的發生發展相關[5]。BCL-2家族屬于凋亡相關蛋白，包括促凋亡因子(Bax、Bak、Bad等)和抗凋亡因子(BCL-2、BCL-xL、BCL-w等)。細胞接收凋亡信號后，線粒體膜滲透性增高，釋放細胞色素C，抗凋亡蛋白可通過抑制細胞色素C的釋放抑制凋亡，其促凋亡蛋白作用與之相反[6]。BCL-2在多種腫瘤如乳腺癌、前列腺癌中表達增高[7-8]，在非小細胞肺癌中BCL-2高表達者預后差[9]；Bax在結腸癌、鼻咽癌中的表達降低[10-11]，在口腔鱗癌中Bax高表達者預后較好[12]。因此，凋亡相關蛋白在不同腫瘤中的表達水平不盡相同，可能與腫瘤的預后有關。本文著重探討骨肉瘤中凋亡相關蛋白BCL-2和Bax的表達，分析磷酸化Axl(P-Axl)與BCL-2、Bax表達的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2010～2013年中山大學附屬第一醫院首診無轉移的41例骨肉瘤石蠟標本，其中男性23例，女性18例；患者年齡8～58歲，平均16.32歲；術后隨訪30～70個月，16例患者死于骨肉瘤。另收集18例骨纖維結構不良石蠟標本作為良性對照組。

1.2 試劑 收集骨肉瘤細胞株MG63、143B、U2OS(中科院上海細胞研究所)，DMEM培養基、胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素雙抗(GIBCO)，P-Axl單克隆抗體和人重組蛋白Gas6(R&D，美國)，BCL-2、Bax單抗(DAKO，丹麥)，順鉑(DDP)、氨甲喋呤(MTX)(大連美侖公司)，Axl siRNA及陰性對照siRNA、RNA提取試劑盒(廣州銳博公司)，X-treme(Roche，美國)，qRT-PCR逆轉錄試劑盒、擴增試劑盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒及引物(Japan Takara)，Hoechst 33258、MTT、DNA檢測試劑盒、免疫組化二抗試劑盒(凱基，中國)，Annexin-V-FITC、TUNEL試劑盒(Roche，德國)，熒光顯微鏡(Leica，德國)，流式細胞儀(Beckman Coulter，美國)。

1.3 Axl siRNA瞬時轉染骨肉瘤細胞系 收集對數生長期的細胞株MG63、143B，提前1天接種于6孔板，密度為30%，當細胞生長密度增至60%，換無血清培養液，每孔1.5 mL，4 h后實驗組每孔加入Axl siRNA 5 μL、opti-mem 500 μL和x-treme 5 μL混合物，對照組加入對照siRNA 5 μL、opti-mem 500 μL和x-treme 5 μL混合物(室溫下已靜置30 min)，輕搖后置于37 ℃培養箱中6 h，換完全培養液，48 h內提取RNA并逆轉錄成cDNA，采用熒光定量PCR進行擴增。Axl引物正向： 5′-TCAAGGTGGCTGTGAAGACGA-3′，反向：5′-CGTTCAGAACCCTGGAAACAGAC-3′；GAPDH引物正向：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAA C-3′，反向：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.4 Hoechst 33258染色檢測凋亡細胞 骨肉瘤細胞株MG63和U2OS分別用濃度為0、400 ng/mL的Gas6預處理24 h，然后用20 μL/mL DDP或600 μL/mL MTX處理24 h。1 μL/mL Hoechst 33258避光室溫染色10 min，熒光顯微鏡下拍照；實驗重復3次。用1-OD(處理組)/OD(對照組)計算抑制率，細胞抑制率高者凋亡細胞百分率(凋亡率)低，細胞抑制率低者細胞凋亡率高。

1.5 MTT法檢測細胞凋亡率 取對數生長期的細胞株MG63和143B，以每孔3×103個接種于96孔板。分別設陰性對照組、Gas6刺激組、Axl siRNA轉染組和Axl siRNA轉染+Gas6刺激組，以此為基礎再分別設置DDP或MTX處理組。細胞接種后孵育過夜，無血清培養4 h轉染Axl siRNA。轉染6 h后繼續無血清培養，然后分別在Gas6刺激組和Axl siRNA轉染+Gas6刺激組加入濃度為200 ng/mL Gas6培養24 h；化療組中DDP的終濃度為20 μg/mL，MTX的終濃度為300 μg/mL，孵育24 h。最終用MTT法檢測不同實驗組細胞的凋亡率。

1.6 Annexin V-FIFC雙染檢測細胞凋亡率 取對數生長期細胞株MG63，以每孔2×105個接種于6孔板中。實驗分組設置與MTT實驗相同。分別用Axl siRNA、Gas6或DDP、MTX處理后，按Annexin V-FITC試劑盒說明書，加入100 μL混合液進行染色，室溫放置15 min后轉入流式硬管中，每管再加入200 μL Buffer，用流式細胞儀以488 nm為激發波長檢測分析各實驗組細胞的凋亡率；各實驗重復3次。1.7 細胞周期檢測 取對數生長期細胞株MG63、U2OS，應用濃度分別為0、100、200、400 ng/mL的Gas6處理48 h。PI染色后，應用流式細胞儀以488 nm為激發波長分析各實驗組的細胞周期；各實驗重復3次。1.8 免疫組化及判斷標準 采用免疫組化EnVision兩步法檢測P-Axl、BCL-2、Bax蛋白表達，選取三位病理醫師采用盲法閱片。按細胞陽性百分比判斷：無陽性細胞為0分，<25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。按細胞陽性強度判斷：0分為陰性，1分為弱陽性，2分為陽性，3分為強陽性。兩者相乘以P-Axl評分≥2分為高表達，<2分為低表達；BCL-2和Bax評分≥2分為陽性，<2分為陰性。

1.9 TUNEL染色檢測骨肉瘤組織中凋亡細胞 隨機選取10例Axl高表達組與10例Axl低表達組，石蠟切片脫蠟、水化，置入含0.1% TritonX-100的10 mmol/L枸櫞酸鹽(pH 6.0)水浴30 min以透膜，1 μg/mL的蛋白酶K 37 ℃消化10 min。每張切片滴加50 μL TUNEL反應混合液，置于37 ℃濕盒避光反應1 h，PBS漂洗3次，熒光顯微鏡下計數凋亡細胞[激發波長為450～500 nm，檢測波長為515～565 nm(綠色)]；計算每張切片的平均陽性率。

1.10 統計學分析 應用兩獨立樣本t檢驗和χ2檢驗進行統計學分析；采用Pearson相關性分析P-Axl、BCL-2和Bax蛋白表達的相關性；應用Cox單因素風險回歸分析骨肉瘤患者預后的危險因素。所有數據采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Gas6/Axl增強骨肉瘤細胞對DDP和MTX的抗凋亡作用 Hoechst 33258染色發現，MG63在DDP或MTX處理后，化療藥所致的細胞凋亡率分別為42.6%和21.9%；Gas6預刺激后，相同濃度的DDP或MTX處理的細胞凋亡率分別降為29.8%和6.4%(P<0.01)。同樣，Gas6預刺激后DDP和MTX對U2OS的細胞凋亡率分別由40.0%和28.6%降為22.8%和16.4%(P<0.05)(圖1A)。MTT實驗發現在MG63和143B中，無論是對照組還是DDP或MTX處理組，均顯示轉染Axl siRNA導致細胞增殖率降低；而Gas6刺激后細胞增殖率明顯增高(P<0.05)；Gas6預刺激后再轉染Axl siRNA，其細胞增殖率與單獨轉染Axl siRNA者相比亦有增高的趨勢(圖1B、C)。Annexin V-FITC檢測發現骨肉瘤細胞株MG63在DDP或MTX分別處理后，其凋亡率由11.16%分別增至16.90%或17.67%；反之，以未處理組細胞為例，Gas6刺激使細胞凋亡率由11.16%降為3.46%；轉染Axl siRNA使細胞凋亡率增至30.09%；而Gas6預刺激后再轉染Axl siRNA，可使細胞凋亡率又降至27.79%。在DDP或MTX處理組也可觀察到類似結果，即Gas6預刺激降低細胞凋亡率，而Axl siRNA協同升高細胞凋亡率(圖2)。與細胞凋亡實驗結果不同的是，不同濃度Gas6(0、100、200、400 ng/mL)的預刺激并不能使MG63、143B細胞周期出現顯著性變化。

圖1 A.骨肉瘤細胞株MG63和U2OS經Gas6預刺激化療藥物DDP和MTX處理后細胞凋亡情況；B.MTT實驗中143B的細胞凋亡率；C.MTT實驗中MG63的細胞凋亡率

2.2 BCL-2、Bax和P-Axl蛋白在骨肉瘤組織中的表達及其與凋亡率的相關性 免疫組化結果顯示BCL-2及Bax蛋白在骨肉瘤細胞質中表達，P-Axl在瘤細胞核質內表達(圖3)；骨肉瘤組織中BCL-2、Bax及P-Axl蛋白表達量明顯高于骨纖維結構不良組織。在41例骨肉瘤組織中，BCL-2陽性者29例(70.7%)，Bax陽性者15例(36.6%)，P-Axl高表達者35例(85.4%)；在18例骨纖維結構不良組織中，BCL-2、Bax陽性者和P-Axl高表達者分別為4例(22.2%)、2例(11.1%)和2例(11.1%)。因此，骨肉瘤組織中BCL-2、Bax和P-Axl的表達顯著高于骨纖維結構不良組織(P<0.05，表1)。Pearson相關性分析顯示：BCL-2與P-Axl蛋白表達呈顯著正相關(r=0.842，P<0.000 1)，Bax與P-Axl、BCL-2的表達呈負相關，但差異無統計學意義。TUNEL實驗證明骨肉瘤組織中P-Axl高表達者細胞凋亡率僅為1%；P-Axl低表達者細胞凋亡率為7%，差異有統計學意義(P<0.05，圖4)。

2.3 BCL-2和Bax蛋白表達與骨肉瘤臨床病理特征的關系 BCL-2和Bax蛋白表達與患者的預后明顯相關(P<0.05，表2)；Cox單因素風險回歸分析發現BCL-2和Bax表達是影響患者預后的因素(P<0.05，表3)。

3 討論

本課題組前期實驗表明，Axl及其配體Gas6的活化可以促進骨肉瘤的發展，提示其預后差。由于P-Axl可抑制骨肉瘤細胞的凋亡[13]，因此Gas6/Axl信號與凋亡相關蛋白的相關性值得深入分析。本組應用骨肉瘤細胞系為基礎，建立Axl siRNA抑制及Gas6刺激活化細胞模型，應用MTT、Annexin V-FIFC等方法，證明骨肉瘤細胞中Gas6與Axl結合并促其磷酸化后抑制化療藥物對骨肉瘤細胞的致凋亡作用。TUNEL實驗亦表明骨肉瘤組織中P-Axl高表達者細胞的凋亡率降低，證明Gas6/Axl在骨肉瘤組織中也發揮抗凋亡作用。此外，免疫組化結果表明P-Axl、BCL-2和Bax蛋白在骨肉瘤組織中表達均高于骨纖維不良組織，Pearson相關性分析顯示BCL-2與P-Axl蛋白表達呈顯著正相關，而Cox單因素風險回歸表明BCL-2或Bax蛋白表達是患者預后的獨立因素，提示P-Axl可能通過調節細胞凋亡蛋白BCL-2抑制骨肉瘤細胞的凋亡，從而促進腫瘤進展。由于本組例數較少，Bax與P-Axl和BCL-2的表達不具有統計學意義，但其負相關趨勢提示三者之間可能存在調節或平衡關系。

表1 BCL-2、Bax和P-Axl蛋白在骨肉瘤和骨纖維結構不良組織中的表達差異

圖2 流式細胞術檢測MG63細胞不同處理組的凋亡細胞數量

隨著新輔助化療在臨床上的廣泛使用，骨肉瘤患者的5年生存率有所提高。近年化療耐藥性已嚴重影響化療藥物的敏感性和有效性。有文獻報道[14]Axl高表達可降低乳腺癌細胞對伊馬替尼的敏感性，使用Axl抑制劑能使乳腺癌細胞恢復對伊馬替尼的敏感。另外，阻斷Axl受體可促進非小細胞肺癌細胞凋亡并增強化療藥物作用[15]。Sinha等[16]報道阻斷Axl受體能促進慢性B淋巴細胞性白血病細胞的凋亡，并具有與酪氨酸激酶抑制劑的協同作用，與本實驗結果一致。AKT通路下游有2條凋亡通路，外通路靶向結合凋亡受體，內通路由細胞線粒體異常引起。在外通路中，細胞的凋亡取決于BCL-2家族因子的平衡[17]； AKT/GSK3β/Cyclin D1/Cdk4通路是另一種以抑制細胞周期而致細胞凋亡的信號通路[18]。本實驗發現Gas6可以不通過影響細胞周期而使骨肉瘤細胞系抗凋亡，表明Gas6可能通過AKT-BCL-2信號通路抑制細胞凋亡，而并非通過AKT-Cyclin D1通路實現作用。Hong等[19]報道耐藥的急性髓系白血病細胞中Axl表達上調，Gas6/Axl活化可能通過促進BCL-2表達進一步產生耐藥性，與本實驗結果一致。

表2 BCL-2 、Bax蛋白表達與骨肉瘤臨床病理特征的關系

③A③B③C④A④B圖3 A．骨肉瘤中BCL?2蛋白的表達，EnVi?sion兩步法；B．骨肉瘤中Bax蛋白的表達，EnVision兩步法；C．骨肉瘤中P?Axl蛋白的表達，EnVision兩步法 圖4 TUNEL法檢測骨肉瘤組織中P?Axl表達狀況與細胞凋亡率的關系：A．骨肉瘤中P?Axl低表達；B．骨肉瘤中P?Axl高表達

表3 Cox單因素回歸分析預后相關因素

綜上所述，本實驗結果提示骨肉瘤中Gas6/Axl活化后通過調節凋亡蛋白BCL-2，促進骨肉瘤細胞抵抗由DDP或者MTX誘發的細胞凋亡，從而促進腫瘤的進展。因此，未來抑制Axl表達或活化可能成為增加化療藥療效、抑制腫瘤進展的治療手段之一。

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Relationship between receptor tyrosine kinase Axl andapoptosis relative proteins in osteosarcoma

JIANG Nian1, WANG Xue-di1, TIAN Rui1, XIE Xian-biao2, LAI Ying-rong1, PENG Ting-sheng1

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofMusculoskeletalOncology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

Purpose To identify the role of tyrosine kinase receptor Axl for anti-apoptosis which was induced by cisplatin (DDP) and methotrexate (MTX) chemotherapy and to analyze the relationship between P-Axl and apoptosis-related proteins in osteosarcoma. Methods Osteosarcoma cell lines MG63, 143B and U2OS were used in apoptosis assays, Axl siRNA transfection, cytotoxicity assays, cell cycle analysis, etc. A total of 41 cases of osteosarcom patients were included for immunohistochemistry of EnVision two-step staining and clinico-pathological relative analysis. TUNEL assay was performed in ten cases for apoptosis detection. Results Among the osteosarcoma cell lines, Gas6/Axl could obviously protect tumor cells from apoptosis induced by DDP and MTX (P<0.05). Axl siRNA transfection enhanced cell apoptosis, whereas Gas6 prone to function upon previous knockdown by Axl siRNA. Among the 41 cases, the positive rate of P-Axl, BCL-2, and Bax was 85.4%, 70.7%, and 36.6%, respectively. In contrast, the positive rate of them was 22.2%, 11.1%, and 11.1% in osteofibrous dysplasia, respectively. The expression levels of these apoptosis-related factors were significantly higher in osteosarcoma than in osteofibrous dysplasia (P<0.05). Through clinico-pathological analysis, there were significant relationships between the survival status and BCL-2 or Bax expression (P<0.05). Pearson correlation analysis demonstrated that BCL-2 was positively correlated to P-Axl with statistical significance (r=0.842,P<0.000 1). By Cox univariate analysis, BCL-2 or Bax was correlated with the patients’ prognosis. TUNEL assay also demonstrated that P-Axl high expression inhibited apoptosis in osteosarcoma tissues. Conclusion Gas6/Axl protects osteosarcoma cells from the apoptosis induced by DDP and MTX chemotherapy and inhibits apoptosis in osteosarcoma tissue, possibly through the regulation of apoptosis-related protein BCL-2.

osteosarcoma； Axl； BCL-2； apoptosis； prognosis

國家自然科學基金(81302348)

中山大學附屬第一醫院1病理科、2骨腫瘤科，廣州 510080

蔣 念，女，碩士研究生。E-mail: candicejang@163.com 彭挺生，女，博士，主任醫師，副教授，通訊作者。E-mail：pengtsh@mail.sysu.edu.cn

時間：2017-5-17 23:52 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.005.html

R 738.3

A

1001-7399(2017)05-0490-07

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.005

接受日期：2017-04-18