乳腺浸潤性導管癌中Livin和MMP-7的表達及臨床意義

韓艷春，張 騫，曹 璋，劉魯英

乳腺浸潤性導管癌中Livin和MMP-7的表達及臨床意義

韓艷春，張 騫，曹 璋，劉魯英

目的 檢測凋亡抑制蛋白家族新成員Livin和基質金屬蛋白酶-7(matrix metallo proteinase 7, MMP-7)在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達，探討兩者表達的相關性及其臨床意義。方法 采用免疫組化SP法檢測Livin和MMP-7在乳腺浸潤性導管癌和癌旁乳腺組織中的表達，并分析兩者表達的相關性及其與乳腺浸潤性導管癌患者臨床病理特征的關系。進一步應用Western blot法檢測乳腺浸潤性導管癌及其相應的癌旁乳腺組織中Livin和MMP-7蛋白的表達水平。結果 Livin和MMP-7在乳腺浸潤性導管癌和癌旁乳腺組織中的陽性率分別為65%vs10% 和73.3%vs25%，且兩者在乳腺浸潤性導管癌組織中的陽性率均高于癌旁乳腺組織(P<0.05)。統計學分析顯示，Livin表達與乳腺浸潤性導管癌患者的淋巴結轉移和TNM分期具有正相關性(P<0.05)，MMP-7表達與乳腺浸潤性導管癌的淋巴結轉移、組織學分級均具有正相關性(P<0.05)。Livin與MMP-7表達具有正相關性(r=0.322，P=0.007)。Western blot結果也表明，Livin與MMP-7蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達水平均高于癌旁乳腺組織。結論 Livin和MMP-7表達與乳腺浸潤性導管癌的轉移有關，兩者可能具有協同作用促進乳腺浸潤性導管癌的發展演進。

乳腺腫瘤；Livin；MMP-7；病理特征；免疫組織化學

目前，乳腺癌的發病率已位居女性惡性腫瘤的首位，乳腺浸潤性導管癌是其最常見的類型，復發和轉移導致的死亡人數較多。已有研究表明，凋亡抑制蛋白家族的新成員Livin和基質金屬蛋白酶-7(matrix metallo proteinase-7, MMP-7)在多種人類惡性腫瘤中呈高表達。有報道顯示干擾Livin表達可調控MMP-2、MMP-9抑制癌細胞的增殖和侵襲能力，兩者在乳腺浸潤性導管癌中表達相互關系尚未見報道。本實驗旨在分析乳腺浸潤性導管癌中Livin和MMP-7的表達，探討兩者表達的相互關系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集濱州醫學院附屬醫院病理科存檔60例乳腺癌組織及20例癌旁乳腺組織標本，其中60例乳腺癌組織蠟塊標本均經病理診斷證實為乳腺浸潤性導管癌。所有患者均為女性，年齡28～75歲。依據美國癌癥聯合委員會(2009)乳腺癌分期標準進行TNM分期[1]：Ⅰ期16例，Ⅱ期27例，Ⅲ期17例；按Scarff-Bloom-Richardson組織學分級標準[2]：Ⅰ級11例，Ⅱ級35例，Ⅲ級14例；無淋巴結轉移者29例，有腋窩淋巴結轉移者31例。另收集濱州醫學院附屬醫院甲乳外科手術切除的16對新鮮原發性乳腺浸潤性導管癌和相應癌旁組織，保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于提取乳腺組織中的總蛋白。所有乳腺癌患者于手術前均未采取任何化療等輔助治療，并簽署知情患者同意書。

1.2 試劑 Livin兔抗人的多克隆抗體購自武漢博士德公司，MMP-7鼠抗人的單克隆抗體、GAPDH鼠抗人的單克隆抗體、免疫組化試劑盒以及DAB顯色試劑盒，均購自北京中杉金橋公司；ECL發光液購自Thermo公司。

1.3 免疫組化 采用免疫組化SP法檢測Livin和MMP-7在乳腺浸潤性導管癌和癌旁乳腺組織中的表達。乳腺組織標本經連續切片制成4 μm厚組織切片，切片經烤片后二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水處理，并應用高溫高壓法進行抗原修復，具體操作按試劑盒說明書進行。Livin抗體(工作濃度為1 ∶50)和MMP-7抗體(工作濃度為1 ∶100)4 ℃孵育過夜。用設已知的Livin和MMP-7陽性乳腺癌切片為陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照。

1.4 結果判斷 免疫組化結果判定采用陽性細胞的比例和細胞染色強度相結合的方法。隨機選擇5個高倍鏡視野，每個視野下計100個乳腺癌細胞，按陽性細胞百分比判斷：無陽性細胞為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；按細胞的染色強度判斷：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以兩者相乘所得分數作為其最終得分，得分≥2分則為陽性；<2分為陰性。

1.5 Western blot法 在新鮮的乳腺浸潤性導管癌組織和相應的癌旁乳腺組織中加入RIPA裂解液于冰上進行孵育處理提取乳腺組織中的總蛋白，并采用Bradford法進行總蛋白濃度的測定。以60 μg總蛋白上樣，于10%SDS-PAGE中電泳，電泳后轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h，分別用Livin和MMP-7抗體(稀釋比例均為1 ∶500)，GAPDH抗體(稀釋濃度為1 ∶1 500)孵育，4 ℃過夜。次日，加以相應的辣根過氧化物酶標記的二抗，于室溫孵育2 h，ECL發光并拍照。采用Image J軟件進行結果條帶灰度值測定，以與內參GAPDH的比值作為Livin和MMP-7的相對表達量。

1.6 統計學處理 應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，用Chi-Square檢驗分別對Livin和MMP-7的表達與乳腺浸潤性導管癌臨床病理特征的關系進行分析，用Pearson相關檢驗對Livin和MMP-7表達的免疫組化結果進行相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺浸潤性導管癌組織中Livin和MMP-7的表達 乳腺浸潤性導管癌組織中Livin和MMP-7陽性染色顆粒均主要定位于乳腺癌細胞胞質內，其陽性率分別為65%(39/60)、73.3%(44/60)。20例癌旁乳腺組織中僅有2例Livin呈陽性；MMP-7在癌旁乳腺組織中有5例呈陽性。乳腺浸潤性導管癌組織中Livin和MMP-7的表達均高于癌旁乳腺組織(P<0.05，表1，圖1、2)。

表1 Livin和MMP-7在不同乳腺組織中的表達

①A①B②A②B

圖1 A.Livin蛋白在乳腺浸潤性導管癌中呈陽性，SP法；B.Livin蛋白在癌旁乳腺組織中呈陰性，SP法 圖2 A.MMP-7蛋白在乳腺浸潤性導管癌中呈陽性，SP法；B.MMP-7蛋白在癌旁乳腺組織中呈陰性，SP法

2.2 Livin和MMP-7表達與乳腺浸潤性導管癌的臨床病理特征關系 采用免疫組化SP法檢測60例乳腺浸潤性導管癌組織中Livin和MMP-7的表達與乳腺癌患者的臨床病理特征關系。結果顯示：Livin表達與乳腺浸潤性導管癌的TNM分期和淋巴結轉移呈正相關(P=0.07，P=0.002)；Livin的表達與乳腺浸潤性導管癌患者年齡、腫瘤大小及組織學分級中差異無統計學意義(P>0.05)；MMP-7表達與乳腺浸潤性導管癌的組織學分級和淋巴結轉移具有正相關性(P=0.08，P=0.013)；與乳腺浸潤性導管癌患者年齡、腫瘤大小及TNM分期差異無顯著性(P>0.05，表2)。

2.3 Western blot檢測 進一步采用Western blot法檢測16對乳腺浸潤性導管癌及其相應的癌旁乳腺組織中Livin和MMP-7蛋白的表達，其結果與免疫組化結果一致，即乳腺浸潤性導管癌組織中Livin和MMP-7蛋白表達水平均高于其相應的癌旁乳腺組織(圖3)。

2.4 Livin和MMP-7蛋白表達的相關性 免疫組化結果顯示，Livin陽性的39例乳腺浸潤性導管癌組織中有33例MMP-7也呈陽性，即兩者同時陽性者33例；Livin陰性的21例乳腺浸潤性導管癌組織中有10例MMP-7亦呈陰性，即兩者同時陰性者10例。應用Pearson相關檢驗對Livin和MMP-7表達進行相關性分析，結果顯示兩者具有明顯正相關性(r=0.322，P=0.007，表3)。

圖3 Western blot法Livin、MMP-7在乳腺浸潤性導管癌及癌旁乳腺組織中的表達：T.乳腺浸潤性導管癌組織；N.癌旁乳腺組織

表2 Livin和MMP-7表達與乳腺浸潤性

表3 Livin和MMP-7表達的相關性分析

3 討論

Livin是由不同的研究小組在同一時期，根據IAP同源序列在人類基因組cDNA文庫中發現，分別稱其為ML-IAP、Livin、KIAP。Livin基因位于人類染色體20q13.3，該基因含有7個外顯子和6個內含子。Livin蛋白N端含有1個桿狀病毒IAP重復序列結構，C端包含1個環指結構[3-5]。

Livin自發現時就已成為腫瘤治療的新靶點，其在細胞生長、腫瘤進展等方面發揮重要作用。以往研究表明，Livin在人類多種惡性腫瘤中表達增加，并與腫瘤的發生、發展密切相關[6-8]。Chung等[9]發現，Livin在正常胃黏膜組織中不表達或呈弱表達，并在淋巴結內轉移癌組織中表達高于無淋巴結轉移的癌組織。干擾Livin的表達后明顯消弱胃癌AGS細胞的增殖和遷移能力。我們在實驗中通過免疫組化SP法和Western blot法檢測乳腺浸潤性導管癌和癌旁乳腺組織中Livin的表達，其結果為乳腺浸潤性導管癌組織中Livin的蛋白表達水平高于癌旁的乳腺組織。進一步對Livin表達與乳腺浸潤性導管癌臨床病理特征分析顯示，Livin高表達與乳腺浸潤性導管癌的TNM分期和淋巴結轉移呈明顯正相關。提示Livin高表達在乳腺浸潤性導管癌發展中起促進作用，并與腫瘤的侵襲轉移有關。

MMP是降解基膜和細胞外基質的重要蛋白水解酶家族，該家族成員的異常表達影響多種疾病的發生、發展[10]，在腫瘤微環境的形成中也發揮重要作用。MMP-7是MMP家族中重要的成員，能夠通過促進蛋白水解作用，降解多種細胞外基質成分，進而促進多種人類惡性腫瘤的浸潤和轉移[11-12]。有文獻報道[13]，MMP-7的表達與結直腸癌患者臨床分期和淋巴結轉移有關。Hsu等[14]發現MMP-7通過降解細胞外基質，增強肺癌的侵襲性，還可通過裂解核仁蛋白引起肺癌的發生。本實驗結果顯示乳腺浸潤性導管癌組織中MMP-7蛋白的表達高于癌旁乳腺組織，其陽性與乳腺浸潤性導管的組織學分期和淋巴結轉移具有正相關性。提示MMP-7蛋白的高表達可能對乳腺浸潤性導管癌的發展和轉移有促進作用。

Lin等[15]通過RNA干擾技術敲除Livin后，下調MMP-2、MMP-9的表達，并抑制肺腺癌A549細胞的增殖和侵襲能力。Qu等[16]報道Livin敲除減弱的胃癌細胞增殖和侵襲能力，同時伴MMP-2表達的降低。MMP-7亦為MMP家族的成員，與MMP-2、MMP-9有許多相同的作用，作者推測Livin可通過調控MMP-7的表達影響乳腺癌的惡性表型。

本實驗結果經統計學分析顯示：Livin和MMP-7蛋白陽性均與乳腺浸潤性導管癌的淋巴結轉移有關，且呈明顯的正相關性，提示兩者可能在乳腺浸潤性導管癌的轉移中呈正向協同作用，Livin可能通過調控MMP-7的表達促進乳腺浸潤性導管癌的淋巴結轉移。乳腺癌的發生、發展、演進和轉移是個多因素、多步驟的過程，本實驗初步分析Livin和MMP-7具有正相關性，是否在乳腺浸潤性導管癌中Livin調控MMP-7的表達、調節腫瘤的轉移及兩者具體的關聯，還有待于深入的分析。

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山東省自然科學基金(ZR2015HL085)

濱州醫學院病理學教研室，煙臺 264003

韓艷春，女，碩士，講師。Tel:(0535)6913215，E-mail: hychrhl7877@126.com 劉魯英，女，博士，副教授，通訊作者。E-mail: llixq@126.com

時間：2017-5-17 23:52 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.006.html

R 737.9

A

1001-7399(2017)05-0497-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.006

接受日期：2017-03-17