沉默缺氧誘導因子-2α對乳腺癌細胞化療敏感性的影響

李 娜，賀國洋，李永真，王志慧

沉默缺氧誘導因子-2α對乳腺癌細胞化療敏感性的影響

李 娜，賀國洋，李永真，王志慧

目的 探討缺氧誘導因子-2α(hypoxia inducible factor-2α, HIF-2α)siRNA對人乳腺癌細胞增殖及化療藥物敏感性的影響。方法 RNA干擾技術沉默MCF-7細胞中HIF-2α的表達；采用免疫細胞化學和RT-PCR法檢測轉染后HIF-2α基因的表達，CoCl2模擬缺氧條件下，采用MTT比色法和流式細胞術檢測不同劑量的化療藥物(5-氟尿嘧啶、阿霉素和紫杉醇)在HIF-2α沉默后對細胞生長抑制率和細胞凋亡的影響。結果 經HIF-2α siRNA處理的MCF-7細胞中HIF-2α基因表達明顯下調(P<0.05)，HIF-2α siRNA處理的MCF-7細胞在不同劑量化療藥物作用后，細胞生長抑制率和細胞凋亡率與對照組相比其明顯增加，化療藥物敏感性明顯增強(P<0.05)。結論 HIF-2α siRNA具有促進化療藥物誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡、抑制增殖及增強化療藥物敏感性的作用，沉默HIF-2α有望成為乳腺癌基因治療的新途徑。

乳腺腫瘤；缺氧誘導因子-2α；RNA干擾；化療敏感性

局部缺氧是實體腫瘤微環境普遍存在的一種現象[1]，缺氧亦是影響惡性腫瘤預后的重要因素。缺氧誘導因子-2α(hypoxia inducible factor-2α, HIF-2α)是其中最主要的調節腫瘤細胞應對局部缺氧等微環境而發生適應性反應的調節因子。課題組前期實驗結果表明，HIF-2α促進乳腺癌細胞的生長、浸潤和轉移，與乳腺癌的發生、發展關系密切[2-3]，同時課題組還證實HIF-2α可以調控多藥耐藥基因1(multiple drug resistance 1, MDR1)的表達，參與乳腺癌多藥耐藥的形成。目前，是否可以通過干擾HIF-2α的表達來逆轉乳腺癌的耐藥性尚未見相關文獻報道。本文擬通過沉默HIF-2α基因的表達，分析其對乳腺癌細胞化療敏感性的影響，為逆轉乳腺癌多藥耐藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 RT-PCR試劑盒和PCR試劑盒等均購自Invitrogen公司；TRIzol試劑、SuperScript First-Strand Synthesis System引物均由上海生工公司合成；β-actin抗體購自Santa Cruz公司；HIF-2α兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德生物公司；5-氟尿嘧啶、阿霉素和紫杉醇購于Pharmasia公司。DMSO購于Sigma公司；MCF-7細胞株由本實驗室保存。熒光顯微鏡為日本Nikon公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與基因轉染 將建立好的缺氧乳腺癌細胞在含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的完全培養基中37 ℃、5%CO2條件下培養，待細胞長至85%融合時，參照Invitrogen公司Lipofectamine 2000說明書進行轉染，設置空白對照組(MCF-7組)、MCF-7/HIF-2α siRNA 組、MCF-7/無義siRNA組，細胞轉染9 h后，更換新鮮完全培養基。

1.2.2 RT-PCR法檢測轉染后各組細胞中HIF-2α mRNA的表達 RNA提取按照Trizol RNA提取試劑盒說明書進行，cDNA第一條鏈體外逆轉錄合成，以cDNA為模板，擴增HIF-2α mRNA。引物序列HIF-2α上游：5′-TGAAAACGAGTCCGAAGCC-3′，下游：5′-GTGGCTGACTTGAGGTTGA-3′；GAPDH上游：5′-ATTCATCTCTCCTCTCCCA-3′，下游：5′-GTTGGTGGTTGGTACTGT-3′，PCR反應條件：94 ℃×2 min，94 ℃×1 min、50 ℃×1 min和72 ℃延伸30 s，28個循環；72 ℃延伸5 min。預期擴增片段大小分別為342 bp和580 bp。取5 μL用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上成像并測定分析。

1.2.3 免疫細胞化學法檢測轉染后各組細胞中HIF-2α蛋白的表達 取少量消化后收集的上述轉染后細胞制作細胞涂片，經10%中性福爾馬林固定20 min，HIF-2α蛋白表達按常規免疫細胞化學染色法進行檢測。DAB染色陽性顯色為棕黃色顆粒，主要位于細胞質和細胞核。所有切片均采用HPIAS-1000高清晰圖像處理系統進行圖像分析，每張切片隨機選取5個視野，取其平均光密度(optical density,OD)的平均值進行統計學分析。

1.2.4 MTT法檢測乳腺癌細胞增殖活性 以每毫升1.5×105個將MCF-7細胞接種于96孔板，每孔加200 μL含10%胎牛血清和CoCl2(終濃度為100 μmol /L)的PRMI 1640培養液，5%CO2、37 ℃孵箱中培養24 h。轉染24 h后各組加入5-氟尿嘧啶(終濃度10 μg/L)、阿霉素(終濃度1.0 μg/mL)和紫杉醇(終濃度10 μg /mL)，培養24 h后加入MTT(終濃度5 mg/mL)每孔20 μL，37 ℃孵育4 h，每孔吸去上清后加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL，酶標儀上讀取570 nm處吸光度值A570。計算各組細胞生長抑制率[抑制率=(空白對照組平均吸光度值-用藥組平均吸光度值)/空白對照組平均吸光度值×100%]，每組實驗至少重復3次。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 將上述3種細胞接種于6 孔培養板，待細胞長至約70 %融合時，加入5-氟尿嘧啶(終濃度10 μg/mL)、阿霉素(終濃度1.0 μg/mL)和紫杉醇(終濃度10 μg /mL)，同時用含100 μmol/L CoCl2的PRMI 1640培養液培養細胞24 h。收集細胞、洗滌固定后過夜。PBS沖洗1次，調整細胞濃度為每毫升106個細胞，加入含RNase(終濃度為0.25 mg/mL)的碘化丙啶(PI)染色液，室溫避光染色30 min，流式細胞儀檢測，Cell Quest分析細胞凋亡情況，低于G0/G1期DNA含量的細胞為凋亡細胞，其所占細胞總數的比例即為凋亡率，每組重復3次。

2 結果

2.1 各組細胞轉染24 h后HIF-2α mRNA的表達 RT-PCR檢測結果顯示：HIF-2α mRNA的相對表達量在MCF-7/HIF-2α siRNA組為0.321±0.036，與MCF-7組(0.724±0.034)和MCF-7/無義siRNA組(0.686±0.039)相比顯著降低(P<0.05)。對照組和MCF-7/無義siRNA組相比差異無顯著性(P>0.05，圖1、2)。

圖1 各組細胞轉染24 h后HIF-2α mRNA的表達

1.MCF-7/HIF-2α siRNA組；2.MCF-7組；3.MCF-7/無義siRNA組；*P<0.05

圖2 轉染24 h后各組細胞中HIF-2α mRNA的相對表達量

與其它各組相比，*P<0.05

2.2 各組細胞轉染24 h后HIF-2α蛋白的表達 免疫細胞化學結果顯示，在3組乳腺癌細胞中HIF-2α蛋白的表達主要定位于胞質(圖3)。采用HPIAS-1000高清晰圖像處理系統進行分析，HIF-2α蛋白的OD值在MCF-7/HIF-2α siRNA組明顯低于轉空質粒組MCF-7組和MCF-7/無義siRNA組細胞(P<0.05)，MCF-7/無義siRNA組和MCF-7組細胞之間未見明顯差異(P>0.05，表1)。

表1 轉染后各組細胞中HIF-2α蛋白的表達

MCF-7/HIF-2α siRNA與MCF-7組、MCF-7/無義siRNA組比較，*P<0.05

2.3 細胞化療敏感性檢測 5-氟尿嘧啶、阿霉素和紫杉醇作用24 h后MCF-7/HIF-2α siRNA組、MCF-7組和MCF-7/無義siRNA組細胞抑制率詳見表2。3種化療藥物處理后MCF-7/HIF-2α siRNA組細胞增殖抑制率均明顯高于MCF-7組和MCF-7/無義siRNA組相應濃度時的細胞增殖抑制率(P<0.05)；MCF-7組和MCF-7/無義siRNA組的細胞增殖抑制率，差異無統計學意義(P>0.05)。

ABC圖3 各組細胞轉染24h后HIF?2α蛋白的表達，SP法：A．MCF?7組；B．MCF?7/無義siR?NA組；C．MCF?7/HIF?2αsiR?NA組

表2 化療藥物處理24 h后各組細胞的細胞抑制率(%)

MCF-7/HIF-2α siRNA組與MCF-7組、MCF-7/無義siRNA組比較，*P<0.05

2.4 細胞凋亡率檢測 5-氟尿嘧啶、阿霉素和紫杉醇作用24 h后MCF-7/HIF-2α siRNA組、MCF-7組和MCF-7/無義siRNA組細胞凋亡率詳見表3。3種化療藥物處理后MCF-7/HIF-2α siRNA組細胞的凋亡率均明顯高于MCF-7組和MCF-7/無義siRNA組相應濃度時的細胞凋亡率(P<0.05)。MCF-7組和MCF-7/無義siRNA組間細胞凋亡率，差異無統計學意義(P>0.05，圖4)。

表3 化療藥物處理24 h后各組細胞的細胞凋亡率(%)

MCF-7/HIF-2α siRNA組與MCF-7組、MCF-7/無義siRNA組比較，*P<0.05

圖4 化療藥物處理24 h后各組細胞的細胞凋亡率

與其它各組相比，*P<0.05

3 討論

局部組織微環境的缺氧是實體腫瘤在生長過程中的常見現象，多由于組織增長過快和血供不足造成。介導腫瘤細胞對缺氧耐受最重要的轉錄因子是缺氧誘導因子[4]，研究表明缺氧誘導因子調節的下游靶基因含有缺氧反應元件(hypoxic responsiveelement, HRE)，缺氧誘導因子可與其結合，形成轉錄起始復合物，啟動下游靶基因的轉錄[5]，對腫瘤新生血管的形成、維持腫瘤細胞的能量代謝、促進腫瘤增殖和轉移、化療耐藥等方面起重要作用[6]。臨床上亦有許多證據表明，腫瘤細胞對缺氧的耐受可使腫瘤對放、化療的抵抗性增加，缺氧存在可能是腫瘤細胞的一些耐藥基因和蛋白的表達或活性增加的主要原因；該過程中缺氧誘導因子起關鍵性作用[7]。HIF是由HIF-α和HIF-β亞基組成的異源二聚體，目前發現的哺乳動物中有3種HIF-α亞基：HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，它們均可與HIF-β亞單位結合[8]，既往對HIF-1α與實體腫瘤關系的相關報道較多，而對HIF-2α與腫瘤的關系卻較少提及。課題組前期實驗結果表明，缺氧可通過核轉錄因子HIF-2α上調乳腺癌細胞內MDR1的表達，從而使乳腺癌細胞獲得多藥耐藥性。本實驗主要通過干擾HIF-2α基因的表達，對乳腺癌細胞化療敏感性的改變進行觀察，為逆轉乳腺癌多藥耐藥提供新思路。

本實驗利用siRNA干擾MCF-7細胞中HIF-2α的表達，siRNA通常為21個核苷酸的雙股RNA(dsRNA)，采用不同轉染技術可將siRNA導入細胞內，并專一性敲弱特定基因的表達。siRNA已成為分析基因功能與藥物目標的一項重要工具[9]。我們利用Lipofectamine 2000介導將針對HIF-2α的siRNA片段轉染到乳腺癌細胞中，特異性降解靶基因的表達。結果顯示，轉染后HIF-2α mRNA的水平明顯降低，蛋白表達也明顯降低。因此，MCF-7/HIF-2α siRNA有效沉默HIF-2α的表達。HIF-2α中VHL泛素-蛋白酶復合體與之結合的位點被CoCl2占據，從而競爭抑制HIF-2α與泛素-蛋白酶復合體的結合，使HIF-2α降解減少，增加細胞內HIF-2α蛋白的表達，CoCl2被廣泛用來模擬缺氧環境[10]。本組前期課題組已經驗證CoCl2(終濃度100 μmol/L)模擬缺氧環境培養各組細胞，并分別加入5-氟尿嘧啶(終濃度10 μg /mL)、阿霉素(終濃度10 μg /mL)和紫杉醇(終濃度10 μg /mL)作用細胞。MTT 檢測結果表明，3種化療藥物處理MCF-7/HIF-2α siRNA組細胞的增殖抑制率均明顯增高。流式細胞術檢測結果也表明，3種化療藥物處理后MCF-7/HIF-2α siRNA組細胞的凋亡率均顯著增加。與前期HIF-1α的報道一致，Gao等[11]發現吉西他濱和5-氟尿嘧啶能夠抑制膽囊癌細胞的增殖和增強其化療敏感性。因此，我們認為應用HIF-2α siRNA體外轉染乳腺癌細胞，抑制乳腺癌細胞中HIF-2α蛋白的表達，提高化療藥物對癌細胞的殺傷力。

綜上所述，乳腺癌是目前女性常見的惡性腫瘤，其發病率逐年上升，已嚴重威脅婦女健康。乳腺癌患者的主要治療手段仍是手術、放療、化療和內分泌治療，其中化療是緩解和治療乳腺癌的重要輔助性治療，眾所周知，乳腺癌化療耐藥是影響患者治療效果的重要因素，本組通過干擾乳腺癌中HIF-2α蛋白的表達，增強乳腺癌細胞的化療敏感性，為臨床逆轉乳腺癌的多藥耐藥、改善患者預后提供新思路。

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Effect of silencing of HIF-2α gene on chemosensitivity of human breast carcinoma cells

LI Na, HE Guo-yang, LI Yong-zhen, WANG Zhi-hui

(DepartmentofPathology,XinxiangMedicalUniversityofHenanProvince,Xinxiang453003,China)

Purpose To investigate the effects of hypoxia inducible factor-2α (HIF-2α) siRNA on proliferation and chemotherapy sensitivity of breast carcinoma MCF-7. Methods RNA interference was used to silence the expression of HIF-2α in MCF-7 cells. The changes of HIF-2α gene expression were detected by immunocytochemistry and RT-PCR. Under hypoxia environment simulated by CoCl2, MTT assay and flow cytometry (FCM) were used to measure cell growth inhibition rate and cell apoptosis of MCF-7 cells under different dosages of chemotherapeutic agents (5-fluorouracil, adriamycin, and paclitaxel). Results Expression of HIF-2α in MCF-7 were down-regulated by HIF-2α siRNA (P<0.05). The proliferation inhibition and apoptosis rates were evidently increased after transfection with HIF-2α siRNA (P<0.05), chemotherapy drug sensitivity was enhanced. Conclusion HIF-2α siRNA can induce the apoptosis and inhibit the proliferation and enhance the sensitivity of breast carcinoma MCF-7 cell line to chemotherapeutic agents. Blocking HIF-2α maybe a very promising strategy for breast carcinoma gene therapy in combination with chemotherapy.

breast neoplasm； hypoxia inducible factor-2 alpha； RNA interference； chemosensitivity

河南省自然科學基金面上項目(162300410220)、河南省衛生廳科技攻關資助(201403133)、河南省教育廳高等學校重點科研(16A310002)

河南省新鄉醫學院病理學教研室，新鄉 453003

李 娜，女，博士，副教授。Tel:(0373)3029123，E-mail: lina@xxmu.edu.cn

時間：2017-5-17 23:53 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.007.html

R 737.9

A

1001-7399(2017)05-0501-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.007

接受日期：2017-03-02