套細胞淋巴瘤中IgH/CCND1融合基因及細胞周期相關蛋白的表達

陳順平，吳文喬，沈洪武，鄒宗楷，蘇海燕，紀思靈，洪少君

套細胞淋巴瘤中IgH/CCND1融合基因及細胞周期相關蛋白的表達

陳順平，吳文喬，沈洪武，鄒宗楷，蘇海燕，紀思靈，洪少君

目的 探討細胞周期相關蛋白Cyclin D1、CDK4、p16蛋白及IgH/CCND1融合基因在套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL)中的表達及相互關系。方法 采用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)法及免疫組化EnVision兩步法聯合檢測40例已利用基因重排技術及免疫組化確診的MCL石蠟包埋組織(實驗組)及20例淋巴結反應性增生的石蠟包埋組織(對照組)，并利用對照組建立MCL的IgH/CCND1融合基因閾值。結果 實驗組中Cyclin D1蛋白陽性率為100%，CDK4蛋白陽性率為87.50%，p16蛋白陽性率為17.50%；實驗組中IgH/CCND1 融合基因的陽性率為100%；對照組中IgH/CCND1 融合基因均陰性。結論 MCL細胞周期調控中Cyclin D1-CDK4-p16通路關系符合腫瘤細胞周期調控原理的闡述；采用FISH技術建立檢測IgH/CCND1融合基因閾值，為國內該融合基因的FISH法判斷提供依據。

套細胞淋巴瘤；CCND1；融合基因；熒光原位雜交

腫瘤的細胞周期調控異常與細胞癌變密切相關，細胞周期調控機制及在p16-Cyclin D1-CDK4-RB通路之間的關系，一直是近年細胞周期調控研究的熱點。細胞周期中Cyclin D1能結合并活化CDK4形成復合物，該復合物能使RB磷酸化并失活，從而調節細胞周期從G1期過渡到S期，促進腫瘤細胞分裂、增殖。p16主要與負向調節細胞周期因子Cyclin D1競爭，并與CDK4結合形成復合物，抑制CDK4的活性，可使低磷酸化或非磷酸化RB積聚，從而抑制細胞增殖。套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL)是一種具有獨特臨床病理特征的B細胞非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)[1]，且Cyclin D1是MCL具有遺傳學異常的特征之一。因此，Cyclin D1、CDK4及p16等關鍵點關系的分析對MCL細胞周期調控機制的整體研究具有重要意義。目前，聯合檢測Cyclin D1、CDK4與p16在MCL中的表達尚未見報道。MCL多通過熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、PCR或者Southern Blotting等方法檢測t(11；14)(q13；q32)易位情況，國內外試劑公司建議血液腫瘤的FISH檢測閾值均以15%作為參考。本實驗利用FISH法及免疫組化EnVision兩步法對明確診斷MCL和淋巴反應增生石蠟包埋組織進行檢測，旨在國內首次建立t(11 ;14)染色體易位產生IgH/CCND1融合基因的閾值，為國內該融合基因的FISH法判斷提供依據，以及探討MCL中Cyclin D1、CDK4及p16的表達及相互關系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集漳州市醫院2011～2015年明確診斷的40例MCL(實驗組)，其中男性25例，女性15例；年齡45～82歲，中位年齡63.5歲。另選淋巴結反應性增生20例作為對照(對照組)；所有標本均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋。

1.2 主要試劑與儀器 探針GLP IgH/CCND1雙色雙融合基因探針由北京金菩嘉公司提供；兔抗CCND1單克隆抗體(即用型)購于福州邁新公司；兔抗CDK4單克隆抗體(即用型)購于北京中杉金橋公司；鼠抗p16INK4a單克隆抗體(即用型)購于福州邁新公司；ABI3130測序儀，Olympus BX51型熒光顯微鏡，Dake原位雜交儀，胃蛋白酶(Sigma產品)。

1.3 免疫組化 免疫組化染色采用EnVision兩步法，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4 FISH檢測 (1)將3 μm厚組織涂膠切片浸于二甲苯中脫蠟至水；(2)100 ℃用ETDA處理組織切片20 min；(3)室溫下用2×SSC×3 min×2次漂洗；(4)組織滴上配制即用型胃蛋白酶，于37 ℃預熱的孵育盒中消化4～8 min；(5)室溫下用2×SSC×3 min×2次漂洗，梯度乙醇脫水固定，自然干燥；(6)避光環境中，探針混合液滴于雜交區域，于83 ℃的自動雜交儀中變性5 min后置于37 ℃過夜雜交；(7)第2日移去蓋玻片，于46 ℃將玻片置于2×SSC×10 min×2次漂洗，置于2×SSC/0.1% NP-40溶液中5 min。玻片干燥后加DAPI復染液，放入暗盒中復染數分鐘后，用Olympus BX51熒光顯微鏡在DAPI/FIFC/RHOD三色濾光鏡激發下觀察間期細胞熒光雜交信號。

1.5 結果判斷 (1)免疫組化判斷：Cyclin D1陽性著色定位于細胞核，CDK4陽性著色定位于細胞核和細胞質，p16陽性著色定位于細胞核和細胞質。根據染色結果≤5%為0分，6%～25%陽性細胞為1分，26%～50%陽性細胞為2分，>50%陽性細胞為3分；根據染色強度無色為0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。將每張切片著色細胞百分率得分與著色程度得分相乘，同一視野如有染色強度不一，取其平均值作最后得分，其中0～3分為陰性(-)；>3分為陽性(+)。(2)FISH結果判斷：IgH/CCND1雙色雙融合基因每例分析200個細胞，單個間期細胞核中紅色及綠色信號數各2個為正常；其中紅色信號代表CCND1基因，綠色信號代表IgH基因，黃色信號為IgH/CCND1融合基因。間期細胞核內≥1個黃色信號，為存在IgH/CCND1融合基因。根據閾值=平均數(M)+3個標準差(SD)建立20例正常標本閾值：異常細胞<26個為正常，≥26個為存在IgH/CCND1單融合基因。

1.6 統計學分析 應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 閾值建立 本實驗采用FISH技術檢測對照組，根據閾值=平均數(M)+3個標準差(SD)建立20例正常標本閾值，IgH/CCND1單融合基因信號閾值為≥13%；對照組未存在IgH/CCND1雙融合基因信號。

2.2 IgH/CCND1融合基因比例及表現形式 實驗組40例石蠟包埋MCL組織均通過基因重排(IgH3+IgK)檢測技術驗證(圖1)；FISH檢測40例實驗組IgH/CCND1融合基因，陽性率達100%(圖2)，均存在MCL的t(11；14)(q13；q32)易位，20例對照組只存在個別黃色信號或未見黃色信號，且陽性率未達到閾值標準(圖3)；實驗組各標本中具有融合信號的細胞比例為19%～96%，大部分病例以單融合基因信號為主，陽性率為14%～60%，小部分以雙融合基因信號為主，陽性率6%～86%，且所有實驗組的標本均有這兩種融合基因信號共同存在。

圖1 IgH TubeB在269.79及316同時出現2個藍色的單克隆峰，PCR毛細管電泳法

2.3 MCL中相關蛋白表達 實驗組石蠟包埋組織40例采用免疫組化EnVision兩步法聯合檢測Cyclin D1、CDK4、p16蛋白的表達，結果顯示Cyclin D1蛋白陽性率為100%(圖4)、CDK4蛋白陽性率為87.50%(圖5)、p16蛋白為17.50%(圖6)。

2.4 Cyclin D1與CDK4、p16蛋白表達的相關性 實驗組免疫組化結果顯示：40例MCL中Cyclin D1與CDK4蛋白表達一致性高；與p16蛋白表達一致性低。

3 討論

淋巴瘤的分型診斷及發病機制一直是人們不斷研究探索的熱點，該類腫瘤還具有其獨特的分子遺傳學及免疫表型特點，CCND1基因重排和(或)高表達是MCL的特征，是與其他淋巴瘤鑒別的重要指標，也是MCL細胞周期調控異常關鍵性因素，而有關MCL細胞周期的調控機制研究，也一直是近年細胞周期調控分析的焦點。在促有絲分裂信號的刺激下，Cyclin D1能結合并活化CDK4形成復合物，Cyclin D1、CDK4是重要的細胞周期蛋白調控基因[2-3]，控制真核細胞從G1期進入DNA合成期S期是關鍵檢測點。在細胞周期調控p16-Cyclin D1-CDK4-RB通路中，若基因異常表達將引起細胞周期調節失控，細胞過度增殖，導致腫瘤的發生、發展[4]。p16則是細胞周期調控p16-Cyclin D1-CDK4-RB通路中負向調節因子，其與Cyclin D1競爭性的同CDK4結合，使細胞增殖過程受到抑制。當p16不能正常表達，失去競爭結合CDK4的能力時，增生的細胞失去控制向癌變發展。所以，闡明G1/S期限制點的Cyclin D1-CDK4-p16通路對細胞周期有至關重要的作用[5]。目前文獻報道MCL多通過檢測t(11；14)(q13；q32)易位產生的IgH/CCND1融合基因，而對于t(11；14)(q13；q32) 易位及Cyclin D1、CDK4與p16等蛋白表達系統性分析尚未見報道，MCL的報道多集中在膽管癌、骨肉瘤、前列腺癌等[6-8]。

②③④⑤⑥圖2 綠色信號的IgH基因與紅色信號的CCND1基因疊加合成黃色信號的IgH/CCND1融合基因，FISH法 圖3 淋巴結反應性增生組織中FISH結果顯示綠色信號的IgH基因與紅色信號的CCND1基因未見疊加合成黃色融合基因信號，FISH法 圖4 MCL組織中CyclinD1蛋白呈陽性，EnVision兩步法

圖5 MCL組織中CDK4蛋白呈陽性，EnVision兩步法 圖6 MCL組織中p16蛋白呈陽性，EnVision兩步法

MCL最具特征的遺傳學異常是t(11；14)(q13；q32)易位，70%～95%的MCL患者具有t(11；14)(q13；q32)染色體易位產生的IgH/CCND1融合基因，且主要通過FISH檢測IgH/CCND1融合基因的存在，PCR法檢測敏感性較低，且較容易污染。對于MCL t(11；14)(q13；q32)易位的檢測，特別是針對石蠟包埋完整組織行FISH檢測t(11；14)(q13；q32)易位，國內外未見大規模報道，且針對如細針組織或微陣列組織等[9]報道檢測腫瘤細胞數較為有限，特別是應用FISH技術檢測，所得結果未能準確反應整體組織情況，大多數文獻對t(11；14)(q13；q32)產生IgH/CCND1融合基因未建立閾值，特別是國內未見建立其閾值，診斷缺少客觀參考標準。本文通過雙色雙融合探針采用FISH技術檢測20例淋巴反應性增生組織，FISH檢測融合基因信號均為單融合基因，未見雙融合基因存在，根據閾值=平均數(M)+3個標準差(SD)，首次建立了國內有關IgH/CCND1單融合基因閾值(13%)。通過建立的閾值對實驗組的40例MCL組織進行IgH/CCND1融合基因行FISH檢測，結果顯示所有標本均存在t(11；14)(q13；q32)易位，各標本融合基因檢測中，大部分病例以單融合基因為主，小部分以雙融合基因為主，且實驗組的標本均有2種融合基因共同存在。本實驗的對照組標本未見有雙融合基因存在，與試劑說明書提供的判斷標準較為不同，其認為異常細胞可見2個融合基因信號，建立雙融合基因閾值，而實際檢測中異常細胞可同時存在單融合基因信號和雙融合基因信號。目前試劑廠家建議血液腫瘤的FISH檢測閾值不管單融合和雙融合基因信號一般以15%作為參考，但在實驗組標本檢測中大部分以單融合基因信號為主，而對照組未見雙融合基因信號存在，只能建立單融合基因閾值。本組利用對照組分別對樣本中200個細胞進行單融合信號和雙融合信號的計數，所得閾值為單融合信號≥13%，但在對照組中未見有雙融合信號存在，一般可認為存在雙融合基因信號或單融合信號≥13%或兩者皆有則可以認為樣本為FISH融合基因陽性。因此，本組建立的閾值來判斷實驗組的融合基因存在的結果與國內外文獻報道一致[9-11]；比熊小亮等[12]采用半巢式PCR 法檢測t(11；14)易位的陽性率高。當MCL中腫瘤細胞極少的情況下進行該融合基因FISH檢測，我們認為雙融合信號比單融合信號更具有特異性，因為只存在于實驗組。因此，在MCL初次診斷時，對樣本雙融合FISH信號數量的檢測具有重要意義，應加以甄別。在FISH實際融合基因信號判斷中應特別注意，信號計數應考慮雙方基因位點空間位置不同引起假陽性結果，融合基因信號存在認定應保證紅色與綠色信號點重疊成黃色信號，紅色與綠色距離相差小于1個信號點且未形成黃色信號不可認定為融合基因信號存在。

本實驗采用免疫組化EnVision兩步法聯合檢測對照組及實驗組中Cyclin D1、CDK4、p16蛋白的表達，以驗證3種蛋白在MCL的表達及相互關系。結果顯示實驗組中Cyclin D1蛋白陽性率為100%、CDK4蛋白陽性率為87.50%，p16蛋白僅有部分表達，陽性率為17.50%；提示CDK4蛋白在Cyclin D1陽性的MCL中陽性率高，但p16蛋白大部分病例不表達，陽性率低；3種蛋白的表達結果顯示MCL細胞周期調控機制中p16在細胞增殖癌變過程中可能受到抑制，失去競爭結合CDK4的能力，使Cyclin D1及CDK4高表達。結果驗證了MCL細胞周期調控中Cyclin D1-CDK4-p16通路中上下關系，與其他腫瘤關于Cyclin D1-CDK4-p16關系的報道相似，但陽性率比其他腫瘤高。

綜上所述，IgH/CCND1融合基因是MCL遺傳學異常的特征之一，Cyclin D1、CDK4蛋白的高表達及p16蛋白低表達是MCL細胞周期調控的特征。

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Expression of IgH/CCND1 fusion gene andcell cycle associated protein in mantle cell lymphoma

CHEN Shun-ping, WU Wen-qiao, SHEN Hong-wu, ZOU Zong-kai, SU Hai-yan, JI Si-ling, HONG Shao-jun

(DepartmentofPathology,ZhangzhouHospitalAffiliatedtoFujianMedicalUniversity,Zhangzhou363000,China)

Purpose To investigate the expression of cell cycle related protein including Cyclin D1, CDK4, p16 and IgH/CCND1 fusion gene in mantle cell lymphoma (MCL) and their relationship with each other. Methods The expression of cell cycle related protein including Cyclin D1, CDK4, p16 and IgH/CCND1 fusion gene were detected on the 40 cases of MCL (expreimental group) and 20 cases of reactive hyperplasia (control group) by using the combined detection of fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunohistochemistry of EnVision two methods. 40 cases of MCL were confirmend by using gene rearrangement technique and immunohistochemistry. The threshold of IgH/CCND1 fusion gene of MCL was established in the control group. Results In the experimental group, Cyclin D1 protein positive expression rate was 100%, the positive expression of CDK4 protein rate was 87.50%, p16 protein positive expression rate was 17.50%. Positive rate of IgH/CCND1 fusion gene of 100%. These cell cycle related protein and IgH/CCND1 fusion gene were negative in the control group. Conclusion In MCL, Cyclin D1-CDK4-p16 pathway is consistent with the principle of tumor cell cycle regulation. The establishment of threshold value of IgH/CCND1 fusion gene by FISH technique may provide the basis for the judgement of FISH of the IgH/CCND1 in China.

mantle cell lymphoma；CCND1； fusion gene； fluorescence in situ hybridization

福建省衛生計生委青年科研課題(2014-2-45)

福建醫科大學附屬漳州市醫院病理科 363000

陳順平，男，主管技師。E-mail: 471231682@qq.com 蘇海燕，女，碩士，副主任醫師，通訊作者。E-mail：sujin000064@163.com

時間：2017-5-17 23:53 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.009.html

R 733

A

1001-7399(2017)05-0511-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.009

接受日期：2017-02-16