不同抗原修復法對免疫組化HBcAg染色結果的影響

黃建平，楊映紅，吳雪晶

不同抗原修復法對免疫組化HBcAg染色結果的影響

黃建平，楊映紅，吳雪晶

HBcAg；抗原修復；免疫組織化學

HBcAg是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的核殼結構蛋白，是HBV的核心成分，它包裹著HBV病毒核酸，易與HBcAb結合形成抗原抗體復合物而被吞噬。HBcAg主要存在于受感染的肝細胞內，其在血液中一般難以被檢測，只有在肝細胞內才能檢出。因此，組織學活檢需行免疫組化染色明確診斷。HBcAg檢測具有重要的臨床指導意義和應用價值，是反映HBV存在及復制程度的直接指標，可與血液HBV DNA檢測互補驗證，但HBcAg檢測常出現染色弱、定位不準確、染色陽性率低等問題。本文現采用不同的抗原修復法進行實驗，以尋找最佳染色方法提高HBcAg染色的準確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料 選取福建醫科大學附屬協和醫院2014年1月～2016年6月肝臟穿刺標本60例，另選取肝組織中HBcAg強表達為陽性對照，以肝組織中HBcAg不表達為陰性對照，切片厚3～4 μm，65 ℃烤箱烤片1 h。

1.2 試劑 一抗HBcAg、EliVision二抗試劑盒、檸檬酸修復液(pH 6.0)、EDTA修復液(pH 9.0)、胰酶、DAB顯色試劑盒，均購自福州邁新公司。

1.3 方法 (1)檸檬酸高壓修復法：將檸檬酸修復液按1 ∶100蒸餾水稀釋后倒入高壓鍋中加熱至沸騰，放入脫蠟水化好的切片，繼續加熱至噴氣，2 min后移除熱源，冷卻至室溫；(2)EDTA煮沸修復法：將EDTA修復液按1 ∶50蒸餾水稀釋后加熱至沸騰，放入脫蠟水化好的切片，維持最低檔溫度繼續加熱煮沸，20 min后移除熱源，冷卻至室溫；(3)胰酶消化修復法：脫蠟水化后切片分別滴加胰酶50～100 μL，放入濕盒中37 ℃溫箱孵育20 min，蒸餾水沖洗終止反應；(4)未修復法：組織切片經脫蠟水化后未做特殊處理。按照上述方法處理后的切片經PBS沖洗1次，3%H2O2孵育10 min；PBS沖洗1次滴加一抗HBcAg，室溫25 ℃孵育120 min，PBS沖洗3次×3 min，滴加增強劑A，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次滴加二抗B，室溫孵育30 min，PBS沖洗，DAB室溫顯色4 min，自來水沖洗，終止顯色，蘇木精復染1 min，0.5%鹽酸乙醇分化10 s，0.5%氨水返藍30 s，流水沖洗5 min，常規脫水、透明、封固。

1.4 結果判定 HBcAg呈棕黃色為陽性，主要定位于胞核或核周胞質，根據表達的強弱可以分為無陽性著色為陰性(-)，淡黃色為陽性(+)，深棕色為強陽性()。

1.5 統計學方法 采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，多組間兩兩比較采用χ2檢驗。

2 結果

60例切片分別經高壓、煮沸、酶消化、未修復4種方法處理，HBcAg表達情況如下。(1)檸檬酸高壓修復：59例(-)、1例(+)，陰陽性對照組均無表達；(2)EDTA煮沸加熱修復：55例(-)、5例(+)，陽性對照組弱表達，陰性對照組無表達；(3)胰酶消化修復：57例(-)、3例(+)，陽性對照組弱表達，陰性對照組無表達；(4)未修復：53例(-)、1例(+)、6例()，陽性對照組強表達，陰性對照組無表達(圖1～4)。

3 討論

近年國內病理學及美國病理醫師和腫瘤學會相繼公布相關免疫組化染色規范章程[1]，明確規定病理標本必須經10%中性福爾馬林固定。甲醛是應用最廣泛的固定液，經甲醛固定的組織形態學良好，能有效保持細胞形態和組織結構的完整性及保存組織細胞內的各有效成分。但是甲醛固定時，組織中的許多氨基酸殘基在分子內或分子間形成醛鍵，使組織中抗原決定簇被封閉。同時，由于甲醛的聚合作用，蛋白質分子間相互交聯形成大分子網絡，也導致抗原決定簇被掩蓋，使部分抗原不能與抗體很好地進行反應，需通過一定的方法修復才能有效進行免疫組化染色。抗原修復能把因甲醛固定而改變的蛋白質結構重新恢復，使免疫組化染色獲得新鮮組織的染色效果[2]。因此，抗原修復是免疫組化染色中非常關鍵的步驟。常用的抗原修復法包括熱修復和酶消化等。加熱抗原修復技術的發明被譽為病理學以及免疫組化的革命性突破[3]。自Shi等[4]首次提出以來，現已應用于日常免疫組化染色中。加熱抗原修復主要能使甲醛固定過程中發生交聯的蛋白質解離，進而暴露與抗體結合的抗原位點，最大程度地恢復在制片過程中損失的抗原性，使原來認為不能在石蠟切片上進行免疫組化的許多抗體獲得良好的染色效果。加熱修復包括高壓修復、水浴加熱修復和微波修復等。酶消化修復也是抗原修復的一種，其原理主要是通過消化作用破壞甲醛固定產生的蛋白交聯，使抗原位點暴露；酶消化修復中用于消化的酶包括胰酶、蛋白酶及胃酶等。

①②③④

圖1 檸檬酸高壓修復：HBcAg無表達，EliVision法 圖2 EDTA煮沸加熱修復：HBcAg呈弱表達，EliVision法 圖3 胰酶消化修復：HBcAg無表達，EliVision法 圖4 未修復：HBcAg呈強表達，EliVision法

本實驗60例肝穿刺組織切片HBcAg染色分別選擇高壓加熱、煮沸加熱、胰酶消化以及未修復4種不同抗原的修復方式，結果顯示高壓加熱修復僅1例弱表達；煮沸加熱修復5例弱表達；胰酶消化修復3例弱表達；未修復1例弱表達，6例強表達。陽性對照組織切片高壓加熱修復時無表達，煮沸加熱及胰酶消化修復時弱表達，未修復時強表達。提示未修復處理效果最佳，煮沸加熱修復和胰酶修復次之，高壓修復效果最差。目前對于免疫組化過程中因甲醛固定引起的抗原封閉，應使用抗原熱修復，打開引起抗原封閉的醛鍵以及交聯蛋白，更充分地暴露抗原、增強染色。高溫高壓熱修復法被認為是大多數抗原修復最為穩定和有效的方法之一[5-6]，然而本組實驗結果與之相反，未修復的切片表達效果最好，高溫高壓修復的切片則表達最差。作者認為可能由于HBcAg是乙肝病毒的核殼結構蛋白，屬于乙肝病毒的一部分，并非人體組織結構成分，因而甲醛固定時并不一定被其封閉。根據Mason等[7]報道甲醛固定所致的蛋白質交聯反應提供加熱修復抗原的可能性，甲醛與蛋白質的交聯物保存抗原的分子結構，使其免受高溫加熱的影響，而加熱能打斷交聯物，暴露抗原達到修復的目的。提示抗原被甲醛固定封閉是加熱抗原修復取得良好效果的前提，但如果抗原未被甲醛固定封閉，加熱修復反而因為高溫使蛋白質抗原發生變性，失去與抗體結合的能力，從而減弱表達甚至不表達。本組實驗也恰好驗證這一結果，高壓修復組因為修復最為激烈，溫度達120 ℃使抗原破壞最為嚴重，表達效果最差；水浴修復組修復溫度100 ℃和胰酶消化組修復相對較為緩和，表達效果較高溫高壓修復組略好；未修復組抗原未受破壞，表達效果最好。

綜上所述，抗原修復方法應用是否得當，直接影響抗體的表達效果，影響病理診斷的準確性。不同抗原具有各自最佳抗原修復條件，沒有一種抗原修復方法適合所有抗原。對于大多數抗原一般提倡熱修復法，但對于某些特殊抗原如HBcAg作用有限，甚至起反作用。因此，合理選擇抗原修復方法需要在實際操作過程中反復摸索、不斷完善。

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福建醫科大學附屬協和醫院病理科，福州 350001

黃建平，男，主管技師。E-mail： 45678197@qq.com

時間：2017-5-17 23:54 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.027.html

R 392.3

B

1001-7399(2017)05-0577-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.027

接受日期：2017-03-26