四種脫鈣液對骨組織HE和免疫組化染色的影響

李 銳，金玉蘭，韓一丁，劉紅剛

四種脫鈣液對骨組織HE和免疫組化染色的影響

李 銳，金玉蘭，韓一丁，劉紅剛

脫鈣液；組織脫鈣；HE染色；免疫組織化學染色

骨是由黏多糖和蛋白纖維構成的有機質及沉積于其中的無機鹽組成，無機鹽主要是羥基磷灰石結晶，其中大部分為磷酸鈣和碳酸鈣；由于骨的特殊構成，使骨組織質地較硬，較難制成切片影響診斷工作，因此制片過程中必須對其脫鈣。目前臨床工作中較常見的脫鈣液是復合酸類脫鈣液，是將2種或2種以上酸類脫鈣液聯合使用，或在單純酸內加入另一種脫鈣液或少量的其他試劑配制而成，能使骨組織中難溶于水的羥基磷灰石快速轉化為易溶于水的酸式磷酸鹽、氯化鈣等，從而使標本軟化。本文參考文獻報道[1-4]配置4種不同成分的脫鈣液，通過對舌骨及股骨頭組織進行脫鈣，比較4種脫鈣液的優缺點，為今后的病理技術工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2015年5月～2016年5月我院手術室送檢全喉切除標本30例、股骨頭組織20例。

1.2 脫鈣液配制 A液：濃鹽酸20 mL加入50 mL的10%中性福爾馬林中，再加入30 mL自來水，制成20%鹽酸甲醛液；B液：取A液100 mL加入10 g氯化鈉，制成20%氯化鈉鹽酸甲醛液。C液：30 mL鹽酸加入70 mL的10%中性福爾馬林，制成30%鹽酸甲醛液；D液：取C液100 mL加入2 mL冰醋酸制成醋鹽酸甲醛液。

1.3 實驗所用儀器及試劑 日本Tissue-Tek VIP全自動脫水機；德國Leica EG1150H石蠟包埋機、Leica2245輪轉式石蠟切片機；日本Tissue-Tek Prisma全自動染色機、Tissue-Tek Film全自動膠片封片機。10%中性福爾馬林及染色的脫蠟液、透明液、乙醇、伊紅、Harris蘇木精試劑，均購自九州柏林公司；濃鹽酸購自北京化工廠。免疫組化采用EnVision法染色；一抗CD61、CD68、CD235a、Ki-67，均購自福州邁新公司；二抗EnVision試劑盒，購自北京中杉金橋公司。

1.4 方法

1.4.1 脫鈣方法 新鮮組織及時用10%中性福爾馬林固定24 h，每例舌骨分別取8～12塊，股骨頭每例取16～20塊，分別制成大小0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm～1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm標本，并做好標記。上述所有骨組織分別分成4份，并確定每份所含骨組織與另外3份成分基本相同，分別放入A、B、C、D四種脫鈣液中，在室溫下進行脫鈣，每24 h更換脫鈣液。

1.4.2 脫鈣終點判定及脫鈣后處理 每間隔1 h觀察1次，標本以手感有彈性、大頭針能輕松刺入為脫鈣完成，所有標本脫鈣后均放入自來水中沖洗30 min，再放入脫水機中脫水處理，第2天石蠟包埋，切片4～6 μm厚，70 ℃烤箱烤片30 min，行常規HE染色，全自動封片機封固。

1.4.3 免疫組化染色 選取4例舌骨組織70 ℃拷片40 min，脫蠟后放入3%H2O2封閉10 min，pH 6.0的檸檬酸抗原修復液高壓鍋修復2.5 min，滴加一抗，37 ℃孵育60 min，經免疫組化EnVision法染色，37 ℃孵育15 min，DAB顯色，核復染、脫水、透明、封固。

2 結果

2.1 脫鈣時間 不同組織采用不同的脫鈣時間，對于舌骨組織D液(醋鹽酸甲醛液)用時最短，其余脫鈣液時間：A液(20%鹽酸甲醛液)>B液(20%氯化鈉鹽酸甲醛液)>C液(30%鹽酸甲醛液)。股骨頭的松質骨在C液和D液中用時較短，而在A液中用時較長；密質骨在A液和B液中用時最長，而在D液中用時最短(表1)。

表1 不同骨組織脫鈣時間

2.2 組織的酸化程度 組織經B液脫鈣后大體變化不明顯，經另外3種脫鈣液處理后短期變化不明顯，但時間超過24 h后組織會輕微發黃，時間越長發黃現象越嚴重。

2.3 切片質量 經4種脫鈣液脫鈣后所有骨組織基本均能完整切片，但經A液和B液處理后的組織，切片過程中部分會有沙粒感，尤其是股骨頭密質骨在切片時感覺較硬，切片刀磨損嚴重，肉眼和鏡下均能看見比較明顯的刀痕；經C液和D液脫鈣后的組織能完整制片，且經D液脫鈣后的組織，切片時組織相對較軟，更易切片。

2.4 HE染色效果 經A液和B液脫鈣后股骨頭密致骨切片不平整，鏡下刀痕明顯，厚薄不均現象常見，且經A液處理后核染色發紅現象明顯，部分核結構不清，但是經B液處理后HE染色核呈紫藍色、染色質結構清晰，核質對比鮮明；經C液和D液脫鈣后的組織鏡下骨組織較平整，骨板結構清晰(圖1)，C液處理后的組織高倍鏡下可見部分核紅染、核結構模糊，核質對比不清晰；經D液處理后的組織核呈紫藍色、發紅現象較少見，核仁結構清晰，核質對比明顯(圖2)。

2.5 免疫組化染色效果 經4種脫鈣液處理后，CD68、CD61、CD235a、Ki-67在骨髓中的表達：CD68、CD235a表達差異不大；CD61在A液、B液和D液中表達均較好，呈棕黃色細胞質陽性(圖3)，而在C液中表達較模糊，染色較淡，甚至呈陰性。Ki-67在B液和D液中呈較強的核陽性(圖4)，在A液和C液液中均呈局灶陽性。

①②③④

圖1 經C液脫鈣的股骨組織：可見骨組織平整，骨板結構清晰 圖2 經D液脫鈣的股骨組織：核藍染，核質對比明顯，核仁清晰 圖3 經B液脫鈣的舌骨骨髓組織：CD61呈陽性，EnVision法 圖4 經D液脫鈣的舌骨骨髓組織：Ki-67呈陽性，EnVision法

3 討論

脫鈣是應用化學或物理的方法將骨組織中的鈣鹽與膠原纖維分離，去除其中較硬的鈣鹽成分，保留完整的膠原纖維。目前需要尋找一種既能有效、快速去除骨組織中的鈣鹽成分，又能很好的保護骨組織細胞結構的脫鈣液。

濃鹽酸是一種強酸，為無機酸，具有極強的揮發性，與骨組織中鈣鹽結合后可加速脫鈣，對組織收縮小，脫鈣均勻完整，能較好保存骨及骨髓組織中的組織和細胞結構，是骨及骨髓組織的理想脫鈣液[5]；且低濃度鹽酸能較好的保持骨組織和骨髓組織的抗原性[6]，是骨及鈣化組織進行免疫組化染色良好的脫鈣液。10%中性福爾馬林是日常工作中尤其是免疫組化常用的固定液，對組織滲透力強、收縮小，能使大多數抗原物質保存較好，由于中性福爾馬林中加入磷酸緩沖液，不易被氧化，故對組織標本的固定(特別是長期固定)、 染色效果非常有利[7]。不同濃度的鹽酸甲醛液在對骨組織脫鈣的同時又能起固定作用，從而減少組織的固定及前期處理時間。因此，本實驗結合以往的工作經驗選擇2種不同濃度的鹽酸甲醛液作為基礎液，再參照以前的研究成果[8-9]，分別加入氯化鈉和冰醋酸，分析幾種脫鈣液的脫鈣效果。

通過對50例骨組織的脫鈣分析，本實驗發現4種脫鈣液基本都能完全脫鈣，其中A液和B液脫鈣速度較慢，D液脫鈣速度較C液快，且經D液處理后的組織切片較平整，核染色較清晰，核質對比明顯，免疫組化染色相對較穩定，可能與醋酸的加入有關。醋酸本身也是一種固定液，其穿透力強，可促進脫鈣液和甲醛固定液在組織內的滲透速度，加速脫鈣[10]，同時醋酸具有使組織尤其是膠原纖維和纖維蛋白膨脹的作用，但通過其他溶液的稀釋，其副作用會明顯降低，并且可抵消鹽酸、甲醛的收縮作用，維持組織細胞的正常結構和形態[11]。除此之外，醋酸對染色體具有固定作用，能較好地保存染色體結構，減少酸對細胞核的破壞。

本實驗中C液和D液的脫鈣時間相差不大，但都比A液快，提示較高濃度的鹽酸甲醛液能加快骨組織的鈣溶解，提高脫鈣速度。Yamamoto-Fukud等[12]也認為酸類濃度越高、脫鈣時間越短，但是曹穎[9]發現不同酸濃度的脫鈣液其脫鈣時間和效果相差不大，這可能與選擇較低濃度鹽酸且濃度之間的差異不大有關(5%～8.5%)。另外，本實驗還發現經B液脫鈣后脫鈣液顏色改變不明顯，組織塊顏色不發黃，HE染色切片透亮，核呈紫藍色、細微結構清晰，核質對比明顯，且脫鈣速度和效果以及免疫組化染色均較A液效果好，說明氯化鈉在加快脫鈣速度的同時又能降低酸對組織的破壞，保護細胞抗原，這可能是由于氯化鈉降低溶液中離子的活度，導致骨組織中無機鹽(羥基磷灰石)的溶解度增加、膠原的酸解程度降低，保證脫鈣骨組織的結構完整性[9]。脫鈣后脫鈣液顏色變黃，組織塊顏色變淺黃，提示組織酸化將影響HE及免疫組化染色[13]，這在本實驗中也得到證實。因此，對于較大的骨組織脫鈣前應將其鋸成薄片的小塊組織，利于脫鈣液的滲透，加快脫鈣速度，減少組織的酸化。

本組中經A液和C液處理后的組織，雖然均能完整切片，但部分組織核染色發紅現象明顯，有時會出現核模糊、核仁結構不清的現象，免疫組化染色不穩定，不利于診斷。另外A液染色所用時間較長，特別是對于密質骨，所需時間更長，而且長時間脫鈣后組織酸化較嚴重，核質對比差，染色質結構欠清晰，因此對于質地較硬的密質骨其應用受到限制。本實驗發現高濃度的鹽酸脫鈣速度較快，HE切片效果較佳，尤其是醋鹽酸甲醛液，其配方簡單，所需試劑在日常工作中較易獲得，是一種較為理想的脫鈣液，但是高濃度的酸會破壞組織及細胞的抗原性，在今后的實際工作中應加以注意，使用高濃度的酸進行脫鈣的標本，應考慮到免疫組化染色假陰性的可能。

20%氯化鈉鹽酸甲醛液對組織的損傷小，HE染色效果好，組織切片透亮，核結構清晰，免疫組化染色較穩定，雖然對于較硬的組織其脫鈣耗時相對較長，但對于較疏松的骨組織及含大量造血細胞的骨髓穿刺標本仍然是一種較好的選擇。

[1] 蘭 淼，鞏 麗，李艷紅，等. 不同脫鈣液對骨髓組織切片HE染色效果的對比研究[J]. 陜西醫學雜志, 2010,39(10):1299,1301.

[2] 吳 璠，吳 鵬. 骨組織標本脫鈣法的改進[J]. 沈陽醫學院學報, 2008,10(1):46.

[3] 楊 紅. Jy-II脫鈣液在骨髓活檢中的應用[J]. 中國現代醫生, 2014,52(24):46-51.

[4] 謝 玲，鄒麗宜，張志平，等. 改良脫鈣液制作脫鈣骨石蠟切片與傳統方法的比較[J]. 中國組織工程研究與臨床康復, 2008,12(11):2125-2128.

[5] 羅燦嶠，莫木瓊，鐘覺民. 不同的脫鈣液在骨組織制片中的比較應用[J]. 中國實用醫藥, 2011,6(19):27-28.

[6] 杜 鵑，柳劍英，蘇 靜. 兩種組織脫鈣法對免疫組織化學染色影響比較[J]. 北京大學學報, 2011,143(2):290-294.

[7] 黃少偉，蘇俊芳，周 瑩，羅 惠. 三種骨組織脫鈣方法的比較[J]. 解剖學研究, 2016,38(1):76-78.

[8] 魏國聯，沈貴華，孫耘田. 一種用于制作骨骼組織切片的新脫鈣液[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2009,25(1):101-102.

[9] 曹 穎. 臨床病理檢驗常用骨組織脫鈣液效果的比較[J]. 第三軍醫大學學報, 2009,31(23):2399-2400.

[10] 羅燦嶠，莫木瓊，聶釗銘，等. 四種脫鈣液對骨和骨髓組織及結構影響的比較[J]. 中國組織工程研究, 2015,19(38):5928-5932.

[11] 孫廷誼，孔令非. 骨與鈣化組織脫鈣方法的改進[J]. 鄭州大學學報(醫學版), 2003,38(6):980-981.

[12] Yamamoto-Fukud T, Shibata Y, Hishikawa Y,etal. Effects of various decalcification protocolson detection of DNAstrand breaks-byterminal dUTP nick end labeling[J]. Histochem J, 2000,32(11):697-702.

[13] 翟莎菲, 阮建平, 朱 勇. 3種不同脫鈣液對牙齒標本切片免疫組化染色效果的研究[J].現代醫藥衛生, 2011,27(8):1122-1123.

首都醫科大學附屬北京同仁醫院病理科，北京 100730

李 銳，女，碩士，技師。Tel:(010)58268683, E-mail：151675007@qq.com 劉紅剛，男，教授，博士生導師，主任醫師，通訊作者。Tel:(010)58268685，E-mail： liuhg1125@163.com

時間：2017-5-17 23:54 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.028.html

R 446

B

1001-7399(2017)05-0579-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.028

接受日期：2017-02-24