非小細(xì)胞肺癌中磷酸化FRK蛋白的表達(dá)及預(yù)后分析

李 麗，寇玉玲，陳 菲，孫興旺

非小細(xì)胞肺癌中磷酸化FRK蛋白的表達(dá)及預(yù)后分析

李 麗1,2，寇玉玲1，陳 菲2，孫興旺1

目的 探討非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中磷酸化FRK(phospho-FRK, p-FRK)蛋白的表達(dá)及其預(yù)后分析。方法 應(yīng)用免疫組化EnVision兩步法檢測162例NSCLC組織及其遠(yuǎn)端對照組織中p-FRK蛋白的表達(dá)水平，并分析p-FRK蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的相關(guān)性，評價p-FRK在NSCLC患者預(yù)后中的價值。結(jié)果 p-FRK蛋白在NSCLC中的陽性率明顯高于遠(yuǎn)端對照組織(51.9%vs11.7%，P=0.001)。p-FRK蛋白陽性水平與NSCLC病理組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期均顯著相關(guān)(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示p-FRK表達(dá)水平與患者術(shù)后總生存率呈負(fù)相關(guān)(χ2=17.849，P<0.001)。多因素生存分析顯示p-FRK蛋白是NSCLC患者術(shù)后不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素(HR=0.496，95%CI：0.295～0.836，P<0.05)。結(jié)論 p-FRK陽性患者預(yù)后較差，有望成為NSCLC患者預(yù)后判斷的新型標(biāo)志物。

肺腫瘤；非小細(xì)胞肺癌；Src激酶家族；p-FRK；預(yù)后

肺癌發(fā)病率與病死率在我國惡性腫瘤中均居首位，在男性及女性中的病死率分別為29.5%和22.5%[1]。肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)，其中80%～85%肺癌為NSCLC，NSCLC進(jìn)一步分為3個病理組織學(xué)亞型：腺癌(30%～40%)、鱗癌(20%～25%)和大細(xì)胞癌(15%～20%)[2]。盡管肺癌的診斷及治療水平不斷發(fā)展，但其5年生存率僅為17%[3]，所以尋找肺癌發(fā)生、發(fā)展及對治療有價值的蛋白尤為重要。近年研究發(fā)現(xiàn)，Src激酶家族可通過影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移、黏附和凋亡，從而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起重要作用[4-9]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Src激酶家族中FRK(fyn-related kinase)在不同類型腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)或抑制腫瘤生長的作用[10-13]。但磷酸化FRK(phospho-FRK, p-FRK)蛋白在NSCLC腫瘤組織中的表達(dá)尚未見報道。本文收集162例肺癌標(biāo)本及其遠(yuǎn)端對照組織，采用免疫組EnVision兩步法檢測兩組中p-FRK表達(dá)強(qiáng)度差異，并分析其與NSCLC臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 收集華西醫(yī)院2007年1月～2007年12月病理科確診為NSCLC且患者術(shù)前均未行放、化療及免疫治療的石蠟標(biāo)本162例。其中男性116例，女性46例，最小年齡34歲，最大年齡81歲，中位年齡60歲。按照第7版國際抗癌組織聯(lián)盟(UICC)的NSCLC分期標(biāo)準(zhǔn)：61例Ⅰ期、38例Ⅱ期、53例Ⅲ期、10例Ⅳ期，其中91例腺癌、71例鱗癌。本組標(biāo)本均通過華西醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且患者簽署書面知情同意書。162例NSCLC組織及其遠(yuǎn)端對照組織均行石蠟切片HE染色，并由兩位病理醫(yī)師分別確認(rèn)病理組織學(xué)類型。

1.2 試劑 一抗為兔抗人p-FRK抗體，購自BeacomBio公司(BIO100431)，工作液稀釋比例1 ∶100；抗體稀釋液(S2022，DAKO，丹麥)；二抗為山羊抗兔/鼠IgG/HRP(K500711，DAKO，丹麥)；50x抗原修復(fù)液(EGTA組織抗原修復(fù)液，MVS-0080，福州邁新公司)；Super PAP Pen超級免疫組化油筆(PEN-0002，福州邁新公司)；Harris蘇木精(7211，Thermo，美國)。

1.3 免疫組化 免疫組化染色采用EnVision兩步法。石蠟標(biāo)本連續(xù)4 μm厚切片，60 ℃烤箱烤片2 h，37 ℃烤箱烤片過夜，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫二甲苯至流水沖洗切片，EGTA(pH 9.0)抗原修復(fù)液98 ℃水浴修復(fù)30 min，3%H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶室溫15 min，滴加100～200 μL的p-FRK(1 ∶100)，4 ℃孵育過夜，室溫復(fù)溫30 min，滴加100～200 μL K500711試劑盒內(nèi)的多聚物酶標(biāo)二抗(即用型)，37 ℃孵育45 min，孵育完畢，DAB在顯微鏡下控制顯色，Harris蘇木精復(fù)染3 min，流水沖洗返藍(lán)，梯度乙醇脫水、二甲苯透明2次，Clearvue封片機(jī)完成封固，Olympus BX51顯微鏡下觀察。每一批次免疫組化實驗均設(shè)置陰性對照，陰性對照用PBS代替一抗。

1.4 結(jié)果判定 p-FRK蛋白陽性定位于細(xì)胞胞質(zhì)，免疫組化結(jié)果由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立閱片進(jìn)行判斷。根據(jù)細(xì)胞著色程度和陽性細(xì)胞占所觀察細(xì)胞百分比的評分乘積進(jìn)行半定量，隨機(jī)選擇200倍視野下10個無交叉重復(fù)的視野，且每個視野下計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，按細(xì)胞著色程度評分：無陽性著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色計為3分。按陽性細(xì)胞所占觀察細(xì)胞百分比評分：無陽性細(xì)胞為0分，≤20%為1分，21%～49%為2分，≥50%為3分。將每一張切片的兩項分值相乘：0為陰性(-)，1～3為弱陽性(+)，4～6為中度陽性()，>6為強(qiáng)陽性()。統(tǒng)計分析時將(-)定義為蛋白陰性，(+～)定義為蛋白陽性[14-15]。

1.5 隨訪 對162例NSCLC患者進(jìn)行電話或定期門診、復(fù)診隨訪。隨訪從手術(shù)之日開始，失訪、死于其他疾病或在隨訪時仍存活視為截尾數(shù)據(jù)?？偵嫫诙x為從第一次確診開始至死亡或隨訪終點時間。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，采用χ2檢驗及Fisher精確檢驗進(jìn)行率的比較分析；生存率采用Kaplan-Meier法分析統(tǒng)計；采用Log-rank檢驗分析各變量與預(yù)后的關(guān)系；采用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC及遠(yuǎn)端組織中p-FRK的表達(dá) NSCLC腫瘤組織中p-FRK陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色彌漫性或顆粒狀著色；遠(yuǎn)端組織中肺泡上皮細(xì)胞、終末細(xì)支氣管上皮細(xì)胞均無明顯p-FRK陽性著色，僅少量細(xì)胞間質(zhì)著色，陽性著色程度及陽性細(xì)胞百分比明顯低于腫瘤組織。NSCLC腫瘤組織中p-FRK蛋白陽性率明顯高于遠(yuǎn)端組織(51.9%vs11.7%，χ2=10.556，P=0.001)，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在162例NSCLC中，p-FRK在腺癌中陽性率高于鱗癌(59.3%vs42.3%，χ2=4.664，P=0.031)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。

AB

圖1 A.肺腺癌中p-FRK呈陽性，EnVision兩步法；B.肺鱗癌中p-FRK呈陽性，EnVision兩步法

2.2 p-FRK表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的相關(guān)性 162例NSCLC中，p-FRK表達(dá)與腫瘤大小有關(guān)，T2+T3+T4組p-FRK的陽性率明顯高于T1組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；p-FRK蛋白表達(dá)水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)；臨床分期Ⅲ+Ⅳ期組p-FRK蛋白表達(dá)水平明顯高于Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.05)。p-FRK表達(dá)與患者性別、年齡均無相關(guān)性(P>0.05，表1)。

表1 p-FRK表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的相關(guān)性

2.3 p-FRK表達(dá)與NSCLC患者生存時間的關(guān)系 應(yīng)用Kaplan-Meier法對162例NSCLC患者進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示：患者總生存期為1～63個月，中位生存期為12個月；患者1～5年生存率分別為85.7%、57.1%、35.4%、19.4%、2.3%(圖2)。p-FRK陽性組與p-FRK陰性組間生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義( χ2=17.849，P<0.001，圖3)。采用Cox風(fēng)險比例模型，將患者性別、年齡、病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、p-TNM分期、p-FRK表達(dá)均納入分析。單因素分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：p-FRK表達(dá)、p-TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與NSCLC患者術(shù)后生存率有顯著相關(guān)性(P<0.001，表2)。將單因素分析中對患者生存率有顯著影響的p-FRK表達(dá)、p-TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移因素納入Cox回歸模型，進(jìn)行多因素分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：p-FRK表達(dá)是肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.01，表3)。

圖2 NSCLC的總生存期曲線

圖3 p-FRK陰性組與陽性組的總生存期曲線

臨床病理參數(shù)WaldP值HR95%CI性別0．0360．8491．0470．651～1．685年齡0．0010．9760．9940．656～1．505病理類型0．0020．9680．9920．653～1．506腫瘤直徑0．3560．5511．1970．663～2．159p?TNM分期12．471<0．0012．2371．431～3．496淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14．483<0．0012．4431．542～3．870p?FRK表達(dá)16．070<0．0012．7031．662～4．396

表3 多因素Cox比例風(fēng)險模型分析NSCLC患者總生存期及預(yù)后風(fēng)險因素

3 討論

非受體酪氨酸激酶Src激酶家族有13種，在人基因組中由Blk、Brk、Fgr、FRK、Fyn、Hck、Lck、Lyn、Src、Srm和Yes共11個成員組成[5]。近年多項研究表明Src激酶家族在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中有關(guān)鍵性作用，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移、黏附和凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[6-9]。近年研究發(fā)現(xiàn)FRK在不同的腫瘤中扮演不同角色，在肝癌和胰腺癌中FRK高表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲[10-11]，在腦膠質(zhì)瘤中FRK抑制腫瘤的生長[12-13]。本組發(fā)現(xiàn)FRK中的p-FRK在NSCLC中高表達(dá)，推測其在肺癌發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。

隨著對腫瘤研究的不斷深入，許多與腫瘤預(yù)后相關(guān)的Src激酶家族也相繼被發(fā)現(xiàn)。Roseweir等[16]報道Lyn核表達(dá)的腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后不良，且Lyn可作為腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后評估的預(yù)測因子。Windischhofer等[17]發(fā)現(xiàn)Src蛋白參與G(a1)/Src/p42/44/MAPK信號通路可誘導(dǎo)早期生長反應(yīng)因子-1(Egr-1)表達(dá)，促進(jìn)骨肉瘤MG-63細(xì)胞株的發(fā)生、發(fā)展。于涓翰等[18]等實驗結(jié)果顯示Brk與Ki-67的協(xié)同表達(dá)是促進(jìn)NSCLC進(jìn)展的重要因素。目前，已發(fā)現(xiàn)的Src家族成員多數(shù)是癌基因，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展。

FRK是Src家族激酶中的一員，Zhou等[12]發(fā)現(xiàn)FRK在人膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平與其惡性程度呈負(fù)相關(guān)，過表達(dá)FRK可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移與侵襲能力。Yim等[5]報道FRK有抑制乳腺癌細(xì)胞生長的作用；但Chen等[10]發(fā)現(xiàn)FRK是肝癌細(xì)胞侵襲的正調(diào)控因子，促進(jìn)腫瘤生長；提示在不同腫瘤中FRK所起的作用也不相同。目前，p-FRK與NSCLC的關(guān)系國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。本組結(jié)果顯示，p-FRK表達(dá)定位于NSCLC腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)而非細(xì)胞核，p-FRK在遠(yuǎn)端對照組織中的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于其在NSCLC組織中表達(dá)水平，p-FRK在肺腺癌中的陽性率高于肺鱗癌。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是肺癌患者重要的轉(zhuǎn)移方式之一，通常與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。本組結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者p-FRK蛋白表達(dá)水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；本實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者p-FRK表達(dá)水平與患者p-TNM分期呈明顯的正相關(guān)(P<0.05)，提示p-FRK陽性程度可能與NSCLC患者的不良預(yù)后相關(guān)。

本組中p-FRK陽性程度與NSCLC患者生存周期明顯相關(guān)。p-FRK陰性組的中位生存期及5年生存率均高于陽性組，推測在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中p-FRK可能起重要作用，但其機(jī)制尚需進(jìn)一步分析。Cox回歸單因素分析發(fā)現(xiàn)，p-FRK表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、p-TNM分期均對NSCLC患者術(shù)后生存率影響顯著，提示p-FRK表達(dá)可能作為NSCLC患者預(yù)后的影響因素。將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、p-TNM分期、p-FRK表達(dá)水平均納入Cox回歸模型進(jìn)行多因素統(tǒng)計分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p-FRK表達(dá)(P<0.01)是NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，提示p-FRK可能成為判斷NSCLC患者不良預(yù)后的標(biāo)志物之一。

綜上所述，p-FRK在NSCLC中的表達(dá)水平明顯升高，且陽性程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存周期有明顯的相關(guān)性，表明p-FRK可作為NSCLC患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子，且有望成為肺癌病理診斷中新的分子標(biāo)志物。但是NSCLC的發(fā)生、發(fā)展是多種因素共同產(chǎn)生的結(jié)果，p-FRK在NSCLC的發(fā)生及轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

[1] 陳萬青，鄭榮壽，張思維，等. 2012年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J]. 中國腫瘤, 2016,25(1):1-8.

[2] Travis W D, Brambilla E, Riely G J . New pathologic classification of lung cancer: relevance for clinical practice and clinical trials[J]. J Clin Oncol, 2013,31(8):992-1001

[3] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2013,63(1):11-30.

[4] Senda Y, Murata-Kamiya N, Hatakeyama M. C-terminal Src kinase-mediated EPIYA phosphorylation of pragmin creates a feed-forward C-terminal Srckinase activation loop that promotes cell motility[J]. Cancer Sci, 2016,107(7):972-980.

[5] Yim E K, Peng G, Dai H,etal. Rak functions as a tumor suppressor by regulating PTEN protein stability and function[J]. Cancer Cell, 2009,15(4):304-314.

[6] Wang R, Li H, Guo X,etal. IGF-I induces epithelial-to-mesenchymal transition via the IGF-IR-Src-MicroRNA-30a-E-Cadherin pathway in nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Oncol Res, 2016,24(4):225-231.

[7] Meng Y, Shukla D, Pande V S,etal. Transition path theory analysis of c-Src kinase activation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016,113(33):9193-9198.

[8] Wang Y D, Bao X Q, Xu S,etal. A novel parkinson’s disease drug candidate with potent anti-neuroinflammatory effects through the Src signaling pathway[J]. J Med Chem, 2016, 59(19):9062-9079.

[9] Mila D, Calderon A, Baldwin A T,etal. Asymmetric Wnt pathway signaling facilitates stem cell-like divisions via the nonreceptor tyrosine kinase FRK-1 in caenorhabditis elegans[J]. Genetics, 2015,201(3):1047-1060.

[10] Chen J S, Hung W S, Chan H H,etal. In silico identification of oncogenic potential of fyn-related kinase in hepatocellular carcinoma[J]. Bioinformatics, 2013,29(4):420-427.

[11] Je D W, O Y M, Ji Y G,etal. The inhibition of SRC family kinase suppresses pancreatic cancer cell proliferation, migration, and invasion [J]. Pancreas, 2014,43(5):768-776.

[12] Zhou X, Hua L, Zhang W,etal. FRK controls migration and invasion of human glioma cells by regulating JNK/c-Junsignaling[J]. J Neurooncol, 2012,110(1):9-19.

[13] Shi Q, Song X, Wang J,etal. FRK inhibits migration and invasion of human glioma cells by promoting N-cadherin/β-catenin complex formation[J]. J Mol Neurosci, 2015,55(1):32-41.

[14] Chen B, Zhang W, Gao J,etal. Downregulation of ribosomal protein S6 inhibits the growth of non-small cell lung cancer by inducing cellcycle arrest, rather than apoptosis[J]. Cancer Lett, 2014,354(2):378-389.

[15] 王志維，雷珍牛，林 輝，等. 119例非小細(xì)胞肺癌中CCR9的表達(dá)及其預(yù)后分析[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2015,31(7):764-768.

[16] Roseweir A K, Qayyum T, Lim Z,etal. Nuclear expression of Lyn, a Src family kinase member, is associated with poor prognosis in renal cancerpatients[J]. BMC Cancer, 2016,16:229.

[17] Windischhofer W, Huber E, Rossmann C,etal. LPA-induced suppression of periostin in human osteosarcoma cells is mediated by the LPA(1)/Egr-1 axis [J]. BMC Cancer, 2012, 94(9):1997-2005.

[18] 于涓翰，張 勇，劉 洋，等. Brk在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及Ki67表達(dá)的關(guān)系[J]. 解剖科學(xué)進(jìn)展, 2013,19 (1):9-12.

Expression of p-FRK and its prognostic analysis in non-small cell lung cancer patients

LI Li1,2, KOU Yu-ling1, CHEN Fei2, SUN Xing-wang1

(1DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China;2LaboratoryofPathology,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

Purpose To investigate the expression of p-FRK protein in non-small cell lung cancer (NSCLC) patients and to explore its prognostic value. Methods The expression of p-FRK protein in tumor tissues and corresponding adjacentnormal pulmonary tissues from 162 NSCLC patients was detected by immunohistochemistry of EnVision two-step. The correlation among p-FRK expression, age, gender, clinicopathologic features, pTNM stage and metastasis of NSCLC patients was also analyzed. whether p-FRK could be used as an independent predictor of prognosis for patients with NSCLC was further determined. Results The positive expression rate of p-FRK in NSCLC tissues (51.9%) was significantly higher than that of adjacent normal lung tissues (11.7%) (P=0.001). The expression of p-FRK in NSCLC was significantly correlated with histopathologic type, lymph node status and pTNM stage (P<0.05). Kaplan-Meier survival analysis showed that there was a negative correlation between p-FRK positive rate and postoperative overall survival (χ2=17.849,P<0.001). Multivariate analysis showed that p-FRK expression was an independent prognostic factor for overall survival of NSCLC patients (HR= 0.496, 95%CI:0.295-0.836,P<0.05). Conclusion As a novel NSCLC biomarker, the expression of p-FRK may predict a poor prognosis in the patients with NSCLC.

lung neoplasm； non-small cell lung cancer； Src kinase family； p-FRK； prognosis

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，瀘州 6460002四川大學(xué)華西醫(yī)院病理研究室，成都 610041

李 麗，女，碩士研究生。Tel: (028) 85164170，E-mail: lilymc@163.com 孫興旺，男，教授，通訊作者。E-mail: lysunxw@163.com

時間：2017-5-17 23:53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.012.html

R 734.2

A

1001-7399(2017)05-0525-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.012

接受日期：2017-03-22